PCSK9在腫瘤發生中的作用及其在免疫治療中的潛在價值*

張欣 汪越 魏嘉

作者單位：南京大學醫學院附屬鼓樓醫院腫瘤中心(南京市210008)

前蛋白轉化酶枯草桿菌素Kexin9型（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9）屬于前蛋白轉化酶（proprotein convertases，PCs）家族。PCs家族是一類內切蛋白酶，主要功能是切割加工前體蛋白使其獲得生物活性。PCs家族共包含九個成員，其中PCSK9是最新發現的成員[1]。近年來PCSK9在腫瘤中的作用受到廣泛的關注，大量的臨床前研究得以開展，包括肝癌[2]、肺癌[3]、乳腺癌[4]等。PCSK9在不同的癌種中通過調節腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲、轉移、放療耐受性等扮演著促進腫瘤的角色。在腫瘤免疫治療領域，PCSK9在調節腫瘤浸潤免疫細胞方面也起到重要作用，聯合使用PCSK9抑制劑或單克隆抗體在腫瘤動物模型的免疫治療中表現出顯著的療效。隨著研究的深入，PCSK9單克隆抗體也被投入抗腫瘤相關臨床試驗，目前仍處于初級探索階段。本文將對PCSK9在腫瘤發生中的作用和機制以及PCSK9在腫瘤免疫治療的潛在價值進行闡述，以期為進一步探索PCSK9在抗腫瘤治療中的應用提供理論依據。

1 PCSK9概述

PCSK9于2003年首次被報道[1]，該基因位于1p32上，含12個外顯子，成熟的PCSK9蛋白是一種非活性可溶性酶原，由前結構域、信號肽、催化結構域和C端結構域組成，主要由肝臟合成分泌，也合成分泌于小腸、腎臟、腦等器官中[5]。最初因其在神經系統的發育中起重要作用，被命名為神經細胞凋亡調節轉化酶-1（neural apoptosis-regulated convertase-l，NARC-1）[6-7]，隨著研究的深入，發現PCSK9可與細胞膜上低密度脂蛋白受體（low-density lipoprotein receptor，LDLR）結合，介導LDLR降解，從而使細胞攝取膽固醇能力下降，血漿中低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）水平升高，導致高脂血癥[8-10]。有研究表明，PCSK9基因的兩種功能獲得型突變（S127R和F216L）增加了LDLR的降解，減少了循環中LDL的清除，與家族性高膽固醇血癥有關[1，11]。近年來，隨著對PCSK9研究的深入，其與腫瘤發生發展的相關性日益突顯，PCSK9可通過調節腫瘤細胞內質網應激、線粒體死亡等多條途徑促進腫瘤的發生發展，此外，PCSK9還可調節腫瘤免疫微環境導致免疫逃逸，靶向PCSK9在抗腫瘤治療中表現出良好的潛力。

2 PCSK9在腫瘤中的作用及相應機制

2.1 PCSK9抑制腫瘤細胞凋亡介導腫瘤發生與進展

抵抗細胞死亡是正常組織向腫瘤轉化的重要特征，腫瘤細胞能通過抑制凋亡因子、抑制凋亡通路的激活等方式抵抗細胞凋亡。PCSK9抑制凋亡因子以腫瘤細胞的凋亡進而介導腫瘤發生與進展，Zhang等[2]研究發現，PCSK9可通過抑制凋亡相關因子抑制肝癌細胞凋亡，這種抑制凋亡作用由下游的脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FASN）介導B淋巴細胞瘤-2（Bcell lymphoma-2，Bcl-2）上調、以及Bcl-2相關X蛋白（BCL2-associated X protein，Bax）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9（cysteinyl aspartate specific proteinase 9，Caspase9）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Caspase3）下調等實現。研究發現PCSK9-siRNA還可以通過調節凋亡相關因子XIAP、survivin蛋白水平以及線粒體凋亡、內質網應激等通路以促進肺腺癌細胞A549、神經膠質瘤細胞U251和神經內分泌瘤細胞BON-1的凋亡[12-14]。此外，PCSK9 可通過多條途徑抑制凋亡通路的激活介導腫瘤進展。Jacome[15]研究發現，PCSK9在卵巢癌中表達水平較癌旁組織高，并且PCSK9過表達能穩定磷酸化AKT，同時細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）1/2表達增加，促進卵巢癌細胞的存活，而siRNA介導的PCSK9下調能抑制其存活，PCSK9小分子抑制劑PF-06446846也起到相同的抑制作用。有研究發現，在胃癌中PCSK9通過上調熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）的表達，激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路調節細胞凋亡，shRNA介導的PCSK9下調能抑制這種作用[16]。此外，在腫瘤轉移動物模型中也發現同樣的作用，Sun等[17]研究發現，敲除PCSK9能夠激活腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）通路促進小鼠黑色素瘤肝轉移模型中的腫瘤細胞凋亡。以上研究表明PCSK9能夠通過調節細胞凋亡相關因子、線粒體凋亡、內質網應激等多條途徑調節不同癌種腫瘤細胞的增殖和凋亡，從而介導腫瘤的發生與進展，而這種作用可以通過抑制PCSK9逆轉。

2.2 PCSK9促進腫瘤細胞侵襲和轉移

侵襲和轉移是大多數腫瘤晚期患者的主要死亡原因，PCSK9與腫瘤的侵襲和轉移具有顯著性相關。有研究將黑色素瘤細胞B16-F1注射到野生型和PCSK9敲除小鼠體內誘導肝臟轉移模型，發現野生型小鼠肝轉移率是PCSK9敲除小鼠肝轉移率的2倍，這種差異由PCSK9敲除后膽固醇水平降低以及TNF-α介導的細胞凋亡增加介導[17]。在Suh等[18]研究中將黑色素瘤細胞B16F10注射到Ahnak基因敲除小鼠體內，使用轉化生長因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β）誘導肺轉移，轉錄組學分析發現PCSK9和其他候選基因參與了黑色素瘤細胞侵入肺組織的過程，而條件性敲除PCSK9基因后轉移受到明顯抑制，進一步的研究發現其與TGF-β誘導的上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關。此外，在胰腺神經內分泌瘤細胞BON-1中，PCSK9是microRNA-224的靶基因，當使用MicroRNA-224agomir或PCSK9-siRNA轉染時，表現出抑制細胞侵襲的作用[13]。PCSK9在胃癌中也表現出同樣的功能，Xu等[16]檢測了7種人源性胃癌細胞系（SGC-7901、MKN-45、MKN-28、KATO-III、AGS、MGC-803、NCI-N87）中PCSK9的表達水平，選擇表達水平最低的MGC-803細胞和表達水平最高的SGC-7901分別建立了PCSK9高表達和PCSK9低表達的胃癌細胞系，發現PCSK9高表達促進了胃癌細胞的侵襲和轉移，其作用機制與HSP70的上調和MAPK信號通路的激活相關。這些研究均說明了PCSK9高表達可通過調節細胞因子、生長因子、EMT及相關信號通路的激活促進腫瘤細胞侵襲和轉移，介導腫瘤進展。

2.3 PCSK9對腫瘤細胞的其他作用及機制

除了發現PCSK9能調節腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲及轉移以外，Gan等[19]研究發現，抑制PCSK9的表達能夠提高前列腺癌的放療耐受性，其作用機制與抑制Bax/Bcl-2、caspase-3、細胞色素C、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）水平相關，該研究使用高劑量放療（8 Gy）處理前列腺癌細胞后，發現PCSK9-siRNA預處理提高了細胞活性，減少了細胞凋亡，表明對腫瘤患者進行放療時保持一定的PCSK9水平可以提高前列腺癌患者放療敏感性，提示PCSK9高水平可能是放療敏感的標志。

3 PCSK9的免疫調節作用及在腫瘤免疫治療中的潛在價值

免疫細胞是腫瘤微環境的重要組成部分，包括抗腫瘤免疫細胞以及促腫瘤免疫細胞。其中T細胞是主要的抗腫瘤免疫細胞。PCSK9在腫瘤中促進腫瘤發生免疫逃逸，其機制與調節T細胞的浸潤與功能相關，靶向PCSK9治療可以逆轉這一現象。此外，PCSK9對腫瘤免疫微環境有潛在的調控作用，包括M2型巨噬細胞的遷移和極化以及影響腫瘤血管生成等。PCSK9在非腫瘤疾病中對DC和巨噬細胞也表現出一定的調控潛力。目前，靶向PCSK9的抑制劑、單克隆抗體和疫苗在腫瘤動物模型中取得了良好的療效，相關臨床試驗也正在開展。

3.1 PCSK9對T細胞的調節作用

PCSK9在調節T細胞的浸潤以及功能方面發揮重要的作用。Liu等[20]研究發現，敲除PCSK9基因后腫瘤細胞成瘤能力明顯減弱，小鼠生存期延長，重新導入PCSK9后致瘤能力恢復，生存期縮短，而這種變化在缺乏T、B和NK細胞的NCG小鼠中未發現，隨后流式檢測發現PCSK9敲除介導瘤內CD8+、CD4+、γδT以及NK細胞的浸潤顯著增加以及細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocytes，CTLs）與調節性T細胞（regulatory T cells，Tregs）的比率、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）陽性或顆粒酶B（granzyme B，GZMB）陽性CTLs的數量顯著增加，進一步的研究發現PSCK9可結合腫瘤細胞表面主要組織相容性復合物I類分子（major histocompatibility complex-I，MHCI），促進MHC-I內吞入胞后在溶酶體被降解，下調腫瘤細胞表面MHC-I水平，進而減少CTLs的浸潤。在另一項研究中，發現LDLR調節CD8+T細胞的功能不完全依賴于LDL水平，還可以與T細胞受體（T cell receptor，TCR）相互作用調節TCR信號轉導，抑制PCSK9從而上調LDLR水平能夠增強CD8+T細胞的抗腫瘤活性[21]。

3.2 PCSK9對腫瘤免疫微環境的調節作用

PCSK9在調節腫瘤相關巨噬細胞的遷移與極化中發揮了重要的作用，巨噬細胞是腫瘤免疫微環境中的重要組成部分，包括腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophage，TAM）、組織駐留巨噬細胞，此外，巨噬細胞可極化為M1和M2型在腫瘤中發揮相反的免疫作用。M2型巨噬細胞能夠分泌多種細胞因子介導抑制性免疫微環境，靶向M2型巨噬細胞具有良好的抗腫瘤治療前景。最新的一項研究發現，PCSK9在體外通過促進肝癌細胞分泌OX40L進而抑制THP-1巨噬細胞遷移并抑制其向M2型巨噬細胞極化[22]。

血管新生是腫瘤的一個重要特征，抗血管生成療法如抗血管生成因子制劑和靶向受體酪氨酸激酶的抑制劑已開發用于抗腫瘤治療，主要以血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和血管內皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）作為靶點。研究發現PCSK9單克隆抗體evolocumab通過增加細胞增殖、遷移、管道形成和VEGF的分泌來促進血管生成，在高濃度下對PCSK9的抑制能顯著提高臍靜脈內皮細胞的活力[23]，提示evolocumab應用于腫瘤治療時可能會起到促進血管新生的促腫瘤作用，因此聯合使用抗血管生成藥物或可能拮抗PCSK9抗體的不良反應，更有利于PCSK9抗體的臨床應用。

3.3 PCSK9在非腫瘤疾病中對免疫細胞的調節作用

目前，關于PCSK9在腫瘤免疫微環境中的作用研究有限，在非腫瘤疾病中PCSK9也表現出調節免疫細胞的潛力，可為其在腫瘤免疫微環境的研究進一步進行提示。樹突狀細胞是免疫系統中功能最強的專職抗原呈遞細胞（antigen presenting cells，APCs），是幼稚CD4+T和幼稚CD8+T細胞主要的激活細胞，具有攝取、加工及遞呈抗原的能力，并表達MHC和共刺激分子（CD80、CD40、CD86和CD70），進而激活效應細胞[24]。在動脈粥樣硬化中，氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，oxLDL）誘導DCs中PCSK9的表達，促進DCs的成熟，增加CD80、CD83、CD86、HLA-DR和清道夫受體（scavenger receptor，SR）血凝素樣氧化型低密度脂蛋白受體-1（lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1，LOX-1）、CD36的表達。該研究將健康人體T細胞與oxLDL誘導后的DCs共培養，發現T細胞IFN-γ和IL-17表達增加，并向Th1及Th17這種具有抑瘤作用的細胞亞群極化。而PCSK9的沉默逆轉了oxLDL對DCs和T細胞的影響，表現為DCs的成熟以及TNF-α、IL-1β和IL-6的生成減少，TGF-β和IL-10的分泌增多，并誘導Tregs的產生[25]。該研究為后續對PCSK9在腫瘤免疫微環境中的機制探索提供了新的方向，PCSK9在腫瘤免疫微環境中是否起到同樣的作用有待進一步的驗證。

關于PCSK9對巨噬細胞的作用，在非腫瘤模型中也有相關報道。Ding等[26]研究發現，將外源性重組PCSK9蛋白與巨噬細胞共孵育，發現PCSK9以劑量依賴性的方式上調清道夫受體SRA、CD36、LOX-1的表達，其中以LOX-1最為明顯，清道夫受體是固有免疫中一類重要的模式識別受體，研究表明其會影響CD8+T細胞的脂質代謝進而影響免疫功能[27]，靶向M2型巨噬細胞上的清道夫受體能夠激活NK細胞，進而提高腫瘤殺傷能力[28]，因此抑制PCSK9的表達及分泌可能是調節腫瘤相關巨噬細胞的潛在的治療靶標。此外，有研究發現PCSK9能夠調節巨噬細胞的膽固醇攝取[29]，LRP5可與PCSK9形成巨噬細胞胞內復合物，介導PCSK9向胞膜轉運。抑制巨噬細胞的PCSK9后，Toll樣受體-4（Toll-like receptor-4，TLR-4）蛋白表達水平降低，NF-κB核轉位減少，以及TNF-α、IL-1β表達和釋放增加，相關炎癥通路下調[30]，另一項研究也得到了相同的結果[31]，提示PCSK9在巨噬細胞中充當調節促炎因子的角色，為腫瘤微環境中PCSK9對巨噬細胞的作用探究提供了指示性的研究方向。結合PCSK9抑制M2型巨噬細胞遷移與極化這一研究結果，PCSK9在腫瘤微環境中對巨噬細胞具體的調節作用，以及在調節巨噬細胞的功能中扮演了什么樣的角色，仍需進一步探索。

3.4 靶向PCSK9在抗腫瘤免疫治療的價值

借助人體自身的免疫系統，去攻擊腫瘤細胞的治療方法被稱為腫瘤免疫治療。近年來，免疫治療在腫瘤治療領域備受關注，已在多個癌種的治療中表現出卓越療效，PCSK9在抗腫瘤免疫治療中也表現出潛在的價值。在兩項臨床前研究中，研究者在小鼠荷瘤模型中分別聯合使用了PD-1抗體和PCSK9抗體/PCSK9小分子抑制劑，結果比單用PD-1抗體或單用PCSK9抗體/PCSK9小分子抑制劑的療效更好[20-21]，其作用機制與抑制PCSK9導致CD8+T細胞浸潤增多以及效應功能增加相關。有研究發現，在胃癌、食管癌、腸癌、肺癌、乳腺癌患者的血清中PCSK9抗體均高于健康人，血清高PCSK9抗體食管癌患者在行根治術后預后更好，并且血清PCSK9抗體水平的升高與PD-L1水平呈正相關[32]，提示在臨床使用PCSK9抗體后PD-L1水平可能會升高，因此聯合使用PDL1抗體或許能達到更好的抗腫瘤療效。

近期，靶向PCSK9的疫苗在腫瘤動物模型中也取得了較好的療效，相較PCSK9單克隆抗體而言，PCSK9疫苗克服了半衰期短、成本高的缺點。研究者將PCSK9短肽（作為B細胞表位）與破傷風毒素肽（作為輔助性T細胞表位）偶聯到納米脂質體表面，以提高其免疫原性[33]。研究發現，PCSK9納米脂質體疫苗在體內能有效地誘導PCSK9特異性抗體，降低血液中PCSK9的水平，在乳腺癌和結腸癌荷瘤小鼠中，該疫苗可以顯著抑制腫瘤生長，延長荷瘤小鼠生存時間，并且未出現明顯的毒副作用，安全性較好[34-35]。

4 結語

綜上所述，PCSK9在多個癌種中可作為獨立的預后因子，通過調節腫瘤細胞增殖與凋亡、侵襲和轉移、提高放療耐受性等方式在不同類型的腫瘤中起到促腫瘤作用，并且能夠直接或間接影響多種免疫細胞的腫瘤浸潤和功能活性。PCSK9抗體聯合使用免疫檢查點抑制劑以及使用靶向PCSK9的納米脂質體疫苗已在動物模型中取得良好的治療療效，目前，PCSK9抗體應用于部分腫瘤，如晚期胰腺癌、晚期腦膠質瘤的臨床試驗也在進行中，旨在探索其對化療和免疫治療的協同作用。雖然PCSK9抗體有一定的臨床應用前景，但目前仍有許多問題亟待闡明。此外，PCSK9在腫瘤免疫治療中的作用初露頭角，研究發現其在腫瘤動物模型中可以調節T細胞的浸潤與功能，在非腫瘤動物模型中可以影響DC、巨噬細胞的代謝及功能，關于PCSK9對腫瘤微環境中其他免疫細胞是否有影響，以及關于免疫治療更多樣的靶向PCSK9治療方式，如聯合回輸特異性腫瘤殺傷細胞等是否能達到更好的療效仍然未知，需更深層次的探索。