男性不育癥患者Caspase-3、Bcl-2表達水平及其與精液常規(guī)參數、精子DNA完整性的關系

王淑林 張長平 翁崇雙

不育癥是指由于男性因素引起的不育，常與染色體異常、內分泌疾病、生殖道感染和輸精道梗阻等因素有關，主要表現為無法使女性受孕，少部分患者可能存在性功能障礙、睪丸疼痛等[1-3]。近年來隨著生活壓力的增大及生活方式的改變，發(fā)病率呈逐年遞增趨勢。臨床常通過精液常規(guī)參數分析評估男性生育能力，包括精子密度和精子形態(tài)等[4]。隨著生殖醫(yī)學發(fā)展，人們對受精能力的評估由精子外在形態(tài)向內在機制逐步轉變。既往研究顯示，男性不育癥與精子凋亡調控失衡密切相關[5]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）作為一種蛋白質，在細胞凋亡中起著重要作用[6]。B 細胞淋巴瘤因子2（Bcl-2）具有較強的抑制細胞凋亡作用[7]。由此推測Caspase-3、Bcl-2 表達水平與男性不育有關。因此，本文旨在探究男性不育癥患者Caspase-3、Bcl-2 表達水平及其與精液常規(guī)參數及精子DNA 完整性的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019 年5 月-2021 年5 月于上饒市婦幼保健院確診的100 例男性不育癥患者，根據世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）標準[8]將患者分為少精組58 例（精子濃度＜20×106/mL）和弱精組42 例（精子濃度≥20×106/mL），另隨機選取在本院進行健康體檢的56 例正常男性作為對照組。納入標準：少精組和弱精組符合文獻[9]臨床對不育癥診斷標準，婚后性生活正常、未采取避孕措施，＞1 年不育。排除標準：（1）合并生殖道外傷；（2）合并器質性疾病；（3）超聲檢查下睪丸、附睪、精索靜脈和輸精管未見明顯異常；（4）臨床資料不完整；（5）存在精神疾病。醫(yī)院倫理委員會對本研究予以審核批準通過，患者及其家屬了解本研究并知情同意。

1.2 方法

1.2.1 Caspase-3、Bcl-2 水平 觀察組患者于入院當天，對照組患者于入院體檢當天采集空腹靜脈血3 mL，將標本放置在-40 ℃的條件下保存，待血液完全凝固后進行離心分離血清（離心半徑8 cm，3 000 r/min，離心10 min），采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測患者Caspase-3，試劑盒購自廣州市銳博生物科技有限公司。采用免疫組織化學法檢測Bcl-2。所有檢測步驟嚴格按照說明書進行。

1.2.2 精液采集與處理 所有患者禁欲3～7 d 后于醫(yī)院留取精液并置于室溫下液化，并取部分進行精液常規(guī)檢查。稱量精液質量并計算精液體積，采用計算機精液分析系統(tǒng)（西班牙CASA 系統(tǒng)）計算精子濃度、精子存活率和精子前向運動率。

1.2.3 精子DNA 完整性 采用美國Irvine Scientific公司生產的ISOLATE 梯度液進行密度梯度離心，離心棄上層清液后留取0.5 mL 沉淀，上游法優(yōu)選精子。采用流式細胞術檢測精子DNA 碎片指數（DNA fragmentation index，DFI），儀器選擇美國貝克曼FC500 生產的流式細胞儀，試劑盒為儀器配套的，操作過程嚴格按儀器與試劑說明書進行。檢測精子流動速度2 min 后收集數據，精子核經過酸和染色處理后利用統(tǒng)計學軟件計算精子DNA 完整性（DFI值），DFI＜15%為精子DNA 完整性較好。

1.3 統(tǒng)計學處理 本研究中所涉及的數據采用SPSS 22.0 軟件進行分析，滿足正態(tài)分布且方差齊的Caspase-3、Bcl-2、精液常規(guī)參數及DFI 值等計量資料采用（）表示，采用單因素方差分析比較三組間差異，采用Bonferroni 檢驗比較三組間兩兩差異；計數資料用率（%）表示，采用χ2檢驗；采用Pearson 相關性分析Caspase-3、Bcl-2 表達水平與精液常規(guī)參數及精子DNA 完整性的關系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組一般資料比較 三組年齡、體重指數、禁欲時間、學歷及吸煙史比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 三組一般資料比較

2.2 三組Caspase-3、Bcl-2 水平及DFI 比較 少精組及弱精組的Caspase-3、DFI 水平均高于對照組，Bcl-2 均低于對照組（P＜0.05），少精組Caspase-3、DFI 水平均高于弱精組，Bcl-2 水平低于弱精組（P＜0.05），見表2。

表2 三組Caspase-3、Bcl-2水平及DFI比較（）

表2 三組Caspase-3、Bcl-2水平及DFI比較（）

*與對照組比較，P＜0.05；#與弱精組相比，P＜0.05。

2.3 三組精液參數比較 少精組及弱精組的精液量、濃度、前向運動率及精子存活率均低于對照組（P＜0.05），少精組精液量、濃度、前向運動率及精子存活率均低于弱精組（P＜0.05），見表3。

表3 三組精液參數比較（）

表3 三組精液參數比較（）

*與對照組比較，P＜0.05；#與弱精組相比，P＜0.05。

2.4 少精組與弱精組Caspase-3、Bcl-2 與精液常規(guī)參數及精子DNA 完整性的關系 少精組與弱精組精液Caspase-3 與精液量、濃度、前向運動率及精子存活率均呈負相關，與DFI 呈正相關（P＜0.05）。Bcl-2 與精液量、濃度、前向運動率及精子存活率均呈正相關，與DFI 呈負相關（P＜0.05），見表4。

表4 少精組與弱精組Caspase-3、Bcl-2與精液常規(guī)參數及精子DNA完整性的關系

3 討論

引起男性不育癥的病因較為復雜，發(fā)病機制也尚未完全明確，現已成為男科領域中極其重要的研究熱點。研究證實，男性不育與精液常規(guī)參數如精液量、濃度及活力有關[10]。另有研究表明，男性不育癥的發(fā)病機制和病因與Caspase-3 及Bcl-2 緊密相連[11-12]。但臨床關于Caspase-3 及Bcl-2 與精液常規(guī)參數和精子DNA 完整性具體關系的探討尚存在一定爭議。故本文旨在就其相關關系進行分析研究。

細胞凋亡是指機體為維持自身內環(huán)境穩(wěn)定，而出現由基因控制的細胞自主且有序的死亡現象，可將機體內發(fā)育不良及變異的細胞主動從體內清除，嚴格控制正常細胞的增殖和衰老[13-14]。但凋亡過程中的紊亂可能會直接或間接導致相關疾病的發(fā)生，其中較為常見的即男性不育癥，其是由于各種因素的影響使精細胞凋亡異常，精子含量減少而引起的[15]。細胞凋亡過程中受到多種蛋白的調控，最為關鍵且重要的是Caspase-3、Bcl-2。本研究中，少精組及弱精組的Caspase-3 水平均高于對照組，Bcl-2 均低于對照組（P＜0.05）。少精組Caspase-3水平高于弱精組，Bcl-2 水平低于弱精組（P＜0.05），提示男性不育癥患者的精子含量越少，Caspase-3越高，Bcl-2 越低。Caspase-3 作為介導凋亡信號的關鍵下游分子，在多種凋亡過程中起著承上啟下的作用。既往研究顯示，Caspase-3 水平增加與男性不育癥患者精子密度減低有關[16]。在正常情況下，機體細胞內存在對Caspase 酶的抑制劑，以降低其被激活時對細胞造成的損傷。但當Caspase-3水平異常升高或抑制劑的水平不足時，會造成細胞凋亡現象，引起精子含量減少，促使男性不育癥的發(fā)生發(fā)展。Bcl-2 作為一種癌基因，可抑制細胞凋亡。Bcl-2 可與Bcl-2 家族的抑制細胞凋亡基因（Bcl-X1）、凋亡相關基因Bcl-X 的突變微基因（Bcl-Xs）等形成同源的蛋白二聚體，而特定的同源二聚體可作為細胞凋亡信號通路上的分子開關[17]。因Bcl-2 可與促凋亡BaX 形成二聚體，若Bcl-2 水平降低，則BaX 相對量高于Bcl-2，BaX 同二聚體的數量增多，從而促進細胞凋亡，引發(fā)男性不育。

本研究中，少精組及弱精組患者的DFI 水平均高于對照組，精液量、濃度、前向運動率及精子存活率均低于對照組（P＜0.05）。說明男性不育癥患者精子DNA 受到損傷，精子發(fā)育水平及線粒體功能下降。臨床常用DFI 表示精子DNA 的完整性，精子DNA 完整性是保證遺傳物質成功傳遞的重要前提，但由于環(huán)境與基因改變、染色體異常等常導致精子魚精蛋白缺乏，造成精子DNA 損傷，出現DNA 碎片化的現象，使DFI 水平升高[18]。精子在進入附睪的過程中會逐漸成熟，但也伴隨著精子的氧化受損和細胞凋亡，精子在附睪內停留的時間越長，精子氧化受損程度越嚴重，使精子活力下降，線粒體功能減退[19]。而精子線粒體代謝功能下降會加重DNA 損傷并影響精子前向運動水平，故引起精液常規(guī)參數水平的下降。本研究中，精液量、濃度、前向運動率及精子存活率與Caspase-3 呈負相關，與Bcl-2 呈正相關，DFI 與Caspase-3 呈正相關，與Bcl-2 呈負相關（P＜0.05）。提示男性不育癥患者Caspase-3、Bcl-2 表達水平及與精液常規(guī)參數、精子DNA 完整性密切相關。因Caspase-3 及Bcl-2表達水平異常均會造成細胞凋亡的發(fā)生，損傷睪丸生精功能。而細胞凋亡主要發(fā)生在精原細胞和精母細胞，導致精子數量的產生減少，活力降低。而研究表明，精子活力與DFI 水平呈負相關，且精子DNA 完整性異常會降低精子存活率[20]，進一步說明男性不育癥患者Caspase-3、Bcl-2 表達水平可反映精子DNA 完整性及精液常規(guī)參數。

綜上所述，男性不育癥患者Caspase-3 水平呈現高表達，Bcl-2 呈低表達，且Caspase-3 與精液常規(guī)參數均呈負相關，與DFI 呈正相關；Bcl-2 與精液常規(guī)參數均呈正相關，與DFI 呈負相關。臨床可通過檢測Caspase-3、Bcl-2 水平評估男性不育癥患者的精液質量和生育能力。本研究不足之處在于納入樣本量偏少，結果存在單一性，臨床應擴大樣本量深入研究證實。