腦缺血再灌注損傷中鈣超載相關通路研究進展

李傳朋 高 穎,2 高永紅,2 蔣 萍 董興魯,2

1.北京中醫藥大學東直門醫院腦病科，北京 100700；2.北京中醫藥大學中醫腦病研究院，北京 100700

中風是目前造成患者致殘率和致死率較高的主要原因之一。我國中風患病率為873.4/10 萬，死亡率為149.49/10 萬[1]。其主要類型為缺血性中風，研究發現在缺血性中風的病理過程中，即使血流恢復了，病情也并不能減輕，反而會進一步加重缺血半暗帶的損傷，這個病理過程稱之為“腦缺血再灌注損傷”，它是急性缺血性中風的核心病理環節，也是目前研究的熱點問題[2]。在腦缺血再灌注中，缺血的組織在恢復血供后會使細胞內Ca2+含量明顯增加，從而引起細胞損傷的現象稱為鈣超載。研究顯示，細胞內鈣超載是中風后腦缺血再灌注損傷的關鍵病理因素[3]，同時也是許多有害因素導致神經元死亡的共同通路[4]，但鈣超載在腦缺血再灌注損傷的上下游病理機制仍需進一步梳理。因此，結合近年來國內外對缺血性中風腦缺血再灌注過程中鈣超載機制的研究進行綜述，以進一步闡明鈣超載上下游的病理機制途徑，以期為研發抗鈣超載中風治療的新藥提供參考。

1 介導鈣超載的機制

1.1 N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體與鈣超載

NMDA 受體是一種Ca2+雙重門控系統，大量分布在神經元突觸后膜[5]。研究顯示，缺血性中風后神經系統的損傷與NMDA 受體密切相關[6]，谷氨酸受體過度激活引起的神經元死亡是由細胞內鈣濃度升高介導的。一方面，缺血性中風發生后，去極化引起的神經元和膠質細胞大量釋放谷氨酸，這些谷氨酸大量聚集在神經細胞突觸部位，與NMDA 受體結合，激活NMDA 受體，造成Ca2+通道打開，Ca2+大量涌入，導致神經細胞鈣超載。有研究將嗜鉻細胞瘤細胞暴露于谷氨酸，觀察到細胞內Ca2+含量增加，使用藥物抑制谷氨酸的釋放可顯著降低細胞內Ca2+含量，減少細胞死亡，證實了谷氨酸誘導細胞損傷的作用與Ca2+內流有關[7]。Park 等[8]在研究槲皮素治療對谷氨酸誘導的神經細胞損傷中海馬鈣蛋白表達的調節作用時，發現谷氨酸興奮毒性顯著增加海馬細胞內鈣濃度，而槲皮素可以減輕鈣超載。另一方面，NMDA 受體包括許多亞型，N-methyl-D-aspartate（NMDA）-R2A subunit（NR2A）與N-methyl-D-aspartate（NMDA）-R2B subunit（NR2B）是NMDA 受體介導Ca2+通道關閉與開放的兩個最主要的亞基，其中NR2B 是主要的磷酸化調控區域[9]。在缺血再灌注過程中，細胞周期蛋白依賴性激酶5（cyclin-dependent kinase-5，CDK5）可與NR2B 相互作用并使NR2B 磷酸化，即在NR2B 加入一個磷酸基團，進而影響NMDA 受體的活性，造成NMDA 受體通道的開放率增加，促進大量Ca2+內流，導致鈣超載的發生[10]。Zhou 等[11]通過一種膜滲透性肽（Tat-CDK5-CTM）特異性破壞CDK5 和NR2B 的結合，然后通過溶酶體介導的途徑導致CDK5 降解。發現Tat-CDK5-CTM 的使用可以抑制氧和葡萄糖剝奪處理的神經元中的鈣超載，結果表明CDK5 通過磷酸化NR2B 參與了鈣超載的發生。

1.2 瞬時受體電位通道2（transient receptor potential melastatin 2，TRPM2）與鈣超載

TRPM2 屬于瞬時受體電位（transient receptor potential，TRP）通道家族的一員，是由細胞內ADP-核糖（adenosine diphosphate ribose，ADPR）門控形成的非選擇性Ca2+通道[12]。TRPM2 通道是介導細胞內Ca2+穩態改變的關鍵機制，TRPM2 通道活性的異常在細胞凋亡中起重要作用，從而破壞各種細胞功能[13]。TRPM2蛋白由胞質N 和C 末端調節域組成，N 末端包含4 個TRPM 通道家族同源成員和1 個位于殘基404～416的鈣調蛋白結合基序。TRPM2 在C 端跨膜結構域具有TRP 區段，分為兩個區域：第二可變區和卷曲螺旋結構域。在TRPM2 的C 末端，盤繞的基序與特定的亞基相互作用，并將TRPM2 組裝成功能性四聚體形式。TRPM2 的C 末端還含有核苷二磷酸連接的X 型同源基序包括11 個殘基的ADPR 結合口袋。ADPR是一種調節Ca2+內流的新型第二信使，并且可以直接打開TRPM2[14]。腦缺血再灌注發生后活性氧（reactive oxygen species，ROS）的升高導致poly-ADPR 聚合酶、poly-ADPR 糖水解酶和DNA 損傷。然后，poly-ADPR聚合酶和poly-ADPR 糖水解酶將煙酰胺腺嘌呤二核苷酸轉化為ADPR 單體以激活TRPM2，促進Ca2+內流，進而導致鈣超載的發生。有研究通過降低TRPM2的表達，觀察到細胞內鈣濃度的降低，并且降低了雄性小鼠海馬神經元的損傷，證實了TRPM2 在介導Ca2+的作用[15]。同時，通過敲低TRPM2，培養的神經元細胞死亡明顯減少。表明TRPM2 促進缺血誘導的神經細胞死亡，而通過使用靶向TRPM2 的RNA 抑制劑TRPM2 siRNA 處理顯著抑制了細胞Ca2+流入和神經元細胞死亡[16]。

1.3 酸敏感離子通道（acid sensitive ion channels，ASICs）與鈣超載

ASICs 屬于表皮鈉通道的一種，它是H+門控型陽離子通道，在細胞外H+濃度增高時被激活開放[17]。ASICs 包含六種亞基，其中一個亞基ASIC1a 在大腦中廣泛表達，對酸離子十分敏感，是導致酸中毒的主要因素，當受到酸離子刺激時，其對Ca2+保持較高的通透性，觸發Ca2+超載，進而導致缺血性損傷后神經元損傷的加重[18]。缺血性中風發生后，血流阻斷和ATP 耗竭引起厭氧糖酵解的代償反應，以提供短暫的能量支持，但導致了乳酸和H+濃度增加[19]。當進行無氧的糖酵解時，腦缺血缺氧極易激活對酸的敏感性，打開對ASIC1a 鈣通透的同聚體通道引起細胞外鈣內流[20]。同時，ASIC1a 膜受體和離子通道的激活也受到pH 值的影響，在腦缺血再灌注期間，氧供應不足致使腦組織進行無氧的糖酵解，產物乳酸和ATP水解產物的積聚致缺血性組織周圍的pH 值顯著下降，嚴重腦缺血時可導致缺血區組織周圍的pH 值明顯降到6.0，缺血缺氧組織酸化時，ASIC1a通道開放，大量Ca2+內流，進而導致鈣超載[21]。此外，Ca2+成像技術也顯示酸中毒可通過ASIC1a 誘導Ca2+進入，并且以谷氨酸受體非依賴性方式促進細胞質Ca2+升高。在培養的皮層神經元中，ASIC1a 激活及其介導的Ca2+進入參與酸中毒誘導的神經元損傷，而ASICs 阻滯劑的應用可顯著降低這種損傷[22]。

1.4 ATP 供應不足影響鈉/鈣交換器（Na+/Ca2+exchanger，NCX）介導鈣超載

ATP 供應充足是細胞鈣穩態的重要條件，而血流通暢又為維持細胞能量穩態提供了重要保障。當缺血性中風發生后，血流的減少導致ATP 的產生大量減少，細胞膜電勢能減弱，造成神經元和膠質細胞去極化，激活Ca2+通道，引發了細胞內的鈣超載[23]。在這個過程中，NCX 扮演著重要的角色。NCX 是一種雙向離子交換轉換器，在生理情況下，它可利用Na+的濃度梯度泵入3 個Na+排除1 個Ca2+。而當能量產生發生障礙時，NCX 的能量供應受到影響，排除Na+的工作停止，細胞內Na+濃度升高。NCX 工作方式發生轉向，即變成泵出3 個Na+泵入1 個Ca2+。前一種生理情況下稱之為“前向模式”，后一種稱之為“反向模式”[24]。NCX 有三種亞型，分別為NCX1、NCX2、NCX3，NCX1在誘導腦缺血/再灌注過程中引起鈣超載起重要作用。基于使用NCX 抑制劑的實驗發現，NCX 反向模式是體內腦缺血-再灌注過程中出現鈣超載的重要誘因[25]。研究表明，當ATP 水平足夠時，激活NCX1的前向模式，NCX1 將Na+泵入細胞并從細胞內泵出Ca2+。而在缺血性再灌注過程中，組織處于缺血缺氧狀態，ATP 的產生大量減少，激活了NCX1 的反向模式，從而導致細胞內鈣超載的發生[26]。另一項研究表明，NCX 可增加鈉瞬變，鈉流入驅動NCX 逆轉，引發大量二次鈣升高，同時促進鈉的輸出，導致離子梯度的破壞，并最終導致了鈣超載[27]。除此之外，通過內源性鈣蛋白酶抑制劑的慢病毒遞送抑制NCX3 的切割可以阻止與神經元死亡相關的繼發性鈣超載。通過表達功能性NCX2 也可阻止鈣超載的發生，從而證實了NCX 通過Ca2+的泵入參與鈣超載的發生[28]。

1.5 高爾基體Ca2+-ATPase（secretory pathway Ca2+-ATPase，SPCA）與鈣超載

SPCA 是定位于高爾基體上的Ca2+泵，分泌型SPCA參與高爾基體Ca2+的釋放和吸收，對腦缺血再灌注過程中鈣超載的發生發揮了重要作用。高爾基體膜泡中濃度的變化趨勢與細胞質濃度變化趨勢正好相反。在缺血和再灌注早期高爾基體膜泡濃度下降迅速，而細胞內Ca2+濃度迅速上升，高爾基體SPCA 通過泵出高爾基體儲存的Ca2+造成了細胞內的鈣超載[29]。Li 等[30]以4 只血管閉塞大鼠為模型，檢測大鼠大腦皮層神經細胞胞質和高爾基體囊泡中SPCA1 的表達和Ca2+濃度的研究表明，高爾基體小泡中Ca2+含量的變化與缺血和再灌注過程中的Ca2+濃度相反。在缺血和早期再灌注過程中，高爾基體小泡急劇下降表明高爾基體參與了建立過程通過唯一的鈣通道肌醇1，4，5-三磷酸受體途徑使細胞質發生鈣超載。而再灌注后期，高爾基體囊泡中的Ca2+濃度迅速恢復，顯示高爾基體可以“緩解”鈣超載的情況。研究表明高爾基體應激對腦缺血和再灌注反應可通過重塑細胞質Ca2+的穩態來實現。

1.6 鈣調蛋白（calmodulin，CaM）介導鈣超載

CaM 是一種多功能的中間信使蛋白，它通過結合Ca2+來轉換鈣信號[31]。研究顯示，在大鼠腦缺血再灌注損傷模型中，缺血再灌注組腦內CaM 活性水平升高[32]。CaM 可通過影響L-型Ca2+電壓門控鈣通道的開放，調節興奮-收縮偶聯中Ca2+進入細胞的過程，進而介導鈣超載的發生，引起破壞性腦功能障礙[33]。Yuan 等[34]研究發現，血漿CaM 水平與急性缺血性卒中引起的神經功能缺損的嚴重程度密切相關，發現CaM 通過介導L-型Ca2+電壓門控鈣通道的開放信號，促進鈣內流引起了鈣超載。

2 鈣超載介導損傷的機制

2.1 導致神經元線粒體裂變和線粒體損傷

缺血性中風可導致線粒體功能障礙。在這個過程中，鈣超載神經元的胞質Ca2+升高造成大量Ca2+進入線粒體，超過線粒體所能承受的鈣閾值，導致線粒體鈣超載，進而造成線粒體損傷、線粒體通透性轉換以及促凋亡蛋白的釋放[35]。在中風后幾小時內一些恢復刺激前Ca2+水平的神經元細胞依然會在之后的時間出現死亡跡象，這種延遲死亡現象是由鈣超載致線粒體損傷造成的，受損的線粒體啟動細胞凋亡樣死亡信號，引發了延遲性細胞死亡[36]。Pivovarova 等[37]為了研究線粒體鈣超載與細胞脆弱性之間的聯系，檢驗只有鈣超載損傷的線粒體亞群釋放凋亡因子的假設，測量了單個線粒體中總Ca2+的濃度，發現延遲死亡的神經元是由于鈣超載導致線粒體亞群釋放凋亡因子，而其他未受損的線粒體維持正常功能。Hu 等[38]研究發現，腦缺血再灌注損傷期間線粒體的變化涉及缺血性再灌注誘導線粒體的過度活化，線粒體功能障礙和延遲的神經元死亡。這是由于細胞內鈣超載刺激了線粒體通透性轉換的持續開放，導致線粒體損傷。

2.2 導致氧化應激

鈣超載激活Ca2+依賴性分解代謝酶，作為第二信使觸發下游信號途徑的級聯事件，伴隨著Ca2+依賴性酶的激活，這些酶上調ROS 的生成，誘導氧化應激，抑制呼吸鏈酶的活性，并促進ROS 介導的信號調節[39]。鈣超載也會導致氧化還原調節的多聚蛋白復合物的開放，促進凋亡蛋白的釋放，從而引發死亡級聯反應。在這些過程中，由過量ROS 產生引起的氧化應激在腦損傷中起主要作用[40]。Ca2+流入產生的ROS 包括超氧陰離子自由基、過氧化氫、羥基自由基、一氧化氮和過氧亞硝酸鹽，由于ROS 的產生，加劇了氧化應激反應[41]。在缺血早期鈣流入啟動下游炎癥和凋亡介質，發生解耦并產生許多ROS，導致了廣泛的氧化應激。ROS 樣自由基通過細胞器膜過氧化破壞脂質、蛋白質和DNA，并導致細胞內細胞器破壞，誘導了細胞凋亡[42]。

2.3 激活內質網應激

內質網是真核細胞內參與分泌蛋白及膜蛋白正確折疊與分泌的重要細胞器，內環境的穩定是實現其功能的基本條件[43]。雖然內質網具有極強的內穩態體系，但在急性缺血性中風發病過程中，病灶區域腦組織因血供不足處于缺血缺氧狀態。此時病灶組織中自由基含量明顯增加，影響內質網膜上的Ca2+泵功能，從而逐步耗竭內質網內的Ca2+，引起細胞內Ca2+超載，鈣超載可通過鈣依賴性蛋白酶引起內質網應激，刺激細胞凋亡。在這個過程中，鈣蛋白酶通過靶向鈣調節蛋白導致鈣從內質網釋放。內質網中Ca2+的長期耗竭會損害蛋白質的加工[44]。導致內質網的內穩態失衡，內質網未折疊的蛋白質會明顯增多，當超出內質網處理能力時，細胞會激活相關信號級聯反應，啟動未折疊蛋白反應來應對條件的變化和恢復內質網良好的蛋白質折疊環境，即內質網應激[45]。但隨著刺激的持續存在，會激活由其介導的凋亡通路，發生細胞凋亡。當內質網功能嚴重受損時，內質網鈣儲存的持續受損再攝取又會加劇細胞內鈣超載，促進μ-鈣蛋白酶的自溶。因此，內質網和鈣超載之間就形成了惡性循環[46]。

3 討論

腦血管疾病是目前危害人類健康的疾病之一，在以缺血性中風為代表的腦血管疾病中，腦缺血再灌注損傷占據著核心病理環節的位置。而鈣超載是缺血性再灌注損傷許多通路的共同環節，基于鈣超載的病理網絡尋找干預途徑具有十分重要的科學意義。在鈣超載的上游網絡中，目前的研究主要集中在谷氨酸興奮毒性、TRPM2、NCX、ASICs，然而在高爾基體、CaM 致鈣超載的過程還有待深入研究。在下游，鈣超載可通過氧化應激、線粒體損傷、內質網應激誘導細胞凋亡，可見細胞凋亡是再灌注損傷許多通路的終末結果，如何在細胞啟動程序化死亡之前，針對上下游的各條網絡通路進行干預，進而大范圍降低細胞凋亡的數量從而減輕缺血性再灌注損傷，是今后一個時期缺血性中風臨床干預的一個重要研究方向。因此，基于鈣超載上下游的網狀機制來探索尋找抗腦血管病干預機制具有廣闊的前景和重要的意義，為缺血性中風新藥研發提供了重要的方向。