肝纖維化動物實驗模型的研究進展

南 洋 董 輝 王志剛 劉樹民

1.黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院，黑龍江哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，黑龍江哈爾濱 150040

肝臟是由細胞與非細胞兩部分組成的，肝纖維化是由多種外界因素刺激肝的非實質(zhì)細胞所導致。致使肝庫普弗細胞、肝竇狀內(nèi)皮細胞、成纖維細胞等分泌大量轉(zhuǎn)化生長因子-β，其導致肝星狀細胞（hepatocellular stellate cell，HSC）或肌成纖維細胞（myofibroblasts，MFB）活化，使細胞外基質(zhì)（extracellular matrixc，ECM）異常堆積，最終導致肝纖維化[1-2]?；罨腍SC 是肝纖維化發(fā)生的核心。肝臟在受到一定的損傷時可以進行自我修復，但是多次的損傷會使肝臟的病變不可逆，導致肝纖維化的產(chǎn)生，進一步會形成肝硬化甚至發(fā)展為肝癌[3]。各種動物模型被用于這一領域，許多學者致力于研究標準的肝纖維化模型，幫助肝纖維化的臨床診斷和治療纖維化藥物的選擇與評價。

1 肝纖維化的機制

肝纖維化是各種原因造成的慢性肝細胞反復損傷所致的肝功能和結(jié)構的病理改變，表現(xiàn)為ECM 的大量合成和分解的減少，引發(fā)ECM 成倍沉積，匯管區(qū)大量纖維組織增生異常。病毒侵襲、先天性代謝缺陷、化合物毒性、自身免疫性肝病等因素均可引起肝纖維化。HSC 的激活是肝纖維化發(fā)生的核心環(huán)節(jié)，HSC 主要作用是識別和降解大分子，分泌細胞因子、生長因子和激素等促進細胞之間的通信及肝臟再生的功能[4]。HSC 為肝的非實質(zhì)性細胞，具有代謝和貯存維生素A 的作用，HSC被激活時轉(zhuǎn)化為另一種促纖維化的細胞，即MFB[5]。

2 實驗模型

疾病研究的基礎是制備出與人類疾病的發(fā)生機制、發(fā)展過程相似的實驗動物模型，并且具有可復制性、操作方便、經(jīng)濟實惠的特點。目前常用的肝纖維化模型造模方法有化學法、飲食法、手術和病毒感染。

2.1 化學方法造模

2.1.1 酒精 酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）通常以肝臟細胞脂肪堆積開始，逐漸進展為肝纖維化和肝硬化。過多的酒精攝入可導致活性氧產(chǎn)生、谷胱甘肽消耗、脂質(zhì)過氧化和膠原合成增加[6]。這些機制誘導肝細胞凋亡、炎癥和HSC 的活化?，F(xiàn)代實驗研究多采用小鼠急性酒精灌胃法，使肝細胞在短時間內(nèi)出現(xiàn)炎癥，引起肝纖維化病變，并將其控制在肝纖維化階段。但ALD 模型主要涉及輕度肝損傷（即脂肪變性和輕中度炎癥），與人類的嚴重ALD 存在差別[7]。為了克服這種問題，目前常采用慢性酒精法與急性酒精法結(jié)合應用，來模擬人類酒精肝纖維化的環(huán)境，但由于造模方法復雜、成功率低，應用并不廣泛。

2.1.2 四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）CCl4對嚙齒類動物具有廣泛的肝臟毒性，是誘導肝纖維化模型中最常用的方法，在很多方面其與毒性損害有關的人類慢性疾病相似。細胞膜上的磷脂分子遭到CCl4的攻擊，形成脂質(zhì)過氧化過程，從而引起小葉中心肝細胞壞死、庫普弗細胞活化和炎癥反應誘導[8]。通過CCl4和3，5-二乙氧基羰基-1，4-二氫誘導肝細胞中的微RNA，導致肝細胞的損傷和再修復[9]。CCl4作用于HSC，使其激活，轉(zhuǎn)化為MFB，MFB 增殖發(fā)展為肝纖維化，而MFB 在短時間內(nèi)迅速地成倍堆積，嚴重時可發(fā)展為肝硬化，更進一步會進展為肝癌[10]。CCl4方法適用于大鼠和小鼠，采用此法應注意特別注射濃度和時間，因為CCl4毒性極高，容易引起肝硬化、急性毒性死亡。此方法的優(yōu)點在于價格低廉、可靠性強和可重復性較高，是目前應用最為廣泛的造模方法。

2.1.3 硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）與CCl4類似，TAA 是一種肝毒性物質(zhì)，經(jīng)細胞色素P450 活化，產(chǎn)生硫代乙酰胺二氧化硫。其引發(fā)肝毒性的作用機制尚不明確，可能是其與脂肪酸、氨基酸發(fā)生反應，而引起毒性[11]。進而造成脂質(zhì)成分過氧化，破壞細胞膜的通透性，導致肝小葉中心死亡，故而誘導HSC 細胞活化，產(chǎn)生肝纖維化。此方法對大鼠更加敏感，但也可以用于小鼠。最近該大鼠模型已標準化，給藥3 次/周，150 mg/（kg·次），為期8～12 周?？诜o藥建模時間將更長一些，當口服濃度為300 mg/L 時，C57BL/6小鼠需要2～4 個月才能發(fā)生顯著肝纖維化[12-13]。TAA 模型是常用的肝纖維化模型，主要用于抗纖維化藥物的評價。

2.1.4 二甲基亞硝胺和二乙基亞硝胺（dimethylnitrosamine/diethylnitrosamine，DMN/DEN）DMN/DEN 均屬N-亞硝基化合物，具有強烈的毒性，主要依靠細胞色素P450 代謝激活，轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋钚缘拇x產(chǎn)物，通過激活DNA 片段、產(chǎn)生活性氧和促進金屬蛋白酶活化等多種方式，引發(fā)肝小葉中心壞死，產(chǎn)生肝細胞癌變[14]。肝組織出現(xiàn)血清總膽紅素顯著升高、肝門脈竇性狹窄、肝門周圍血管擴張、肝假小葉形成和炎癥細胞浸潤等，還有部分可見明顯的膠原纖維增生等現(xiàn)象[15]。Ding 等[16]利用大鼠建立了全面的肝炎-肝纖維化-肝癌模型，為肝病發(fā)展的不同階段模型建立提供了參考。此研究顯示，注射DEN（30 mg/kg）2 次/周，8～12 周病理學可觀察到肝臟進入到肝纖維化階段?；蛴?%的DMN 溶液（1 ml/kg），腹腔注射1 次/d，3 d/周，連續(xù)4 周[17-18]，也可以形成肝纖維化。

2.2 飲食方法造模

2.2.1 蛋氨酸和膽堿缺乏（methionine and choline deficient，MCD）飼料 目前常用MCD 飼料構建研究非酒精性脂肪性肝炎模型。該模型的特點是脂肪酸從脂肪組織流向肝臟和增加甘油三酯，庫普弗細胞可能在MCD 飼料誘導的肝脂肪變性的起始和進展中發(fā)揮作用，因為其是肝細胞損傷的第一個應答者[19]。巨噬細胞的浸潤還可以促進促炎癥通路和介質(zhì)的上調(diào)，HSC 細胞被激活將引導病理進入纖維化的階段。研究中發(fā)現(xiàn)，NOD 樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體激活后，使用NLRP3 選擇性抑制劑可以顯著減緩肝纖維化進展[20]。喂食MCD 飼料的小鼠在8 周后出現(xiàn)脂肪性肝炎[21]，而肝纖維化的階段需要更長時間的喂養(yǎng)才可觀察到[22]。然而這種飲食模式構建的動物模型缺乏一些人類患者的主要病理特征，如無血清胰島素、空腹血糖、瘦素和甘油三酯等水平降低。目前常采用復合造模的方式以改善上述不足，在MCD 飼料的基礎上結(jié)合基因修飾小鼠，能更好地模擬人類肝纖維化特點[23]。

2.2.2 高脂類飼料 非酒精性脂肪性肝炎主要是由于過量食用高脂肪類成分而引起的，患者吸收營養(yǎng)過多而缺乏基本運用，從而導致肝細胞內(nèi)脂肪過度積累形成肝纖維化。高脂肪飼料克服了MCD 飼料的缺點，因為動物體重增加和外周胰島素抵抗發(fā)展，該模型通過復制不良生活習慣來模擬疾病的病因，具有與人類非酒精性脂肪性肝炎相似的表型特征。但在小鼠中需要52 周才能發(fā)展為僅伴有輕度纖維化的脂肪性肝炎[24]。雄性近交C57BL/6 小鼠是最適合使用高脂肪飲食發(fā)生非酒精性脂肪性肝炎的嚙齒動物，但這種飲食模式的主要缺點是缺乏肥胖和胰島素抵抗。此種造模方式操作簡單，可重復性強，能表現(xiàn)出與類似于人體內(nèi)肝臟的內(nèi)環(huán)境病變。這種模型適用于高脂類肝纖維化的病理機制和用藥篩選。

2.3 手術方法造模

膽總管結(jié)扎可造成膽汁淤積損傷和門靜脈周圍膽道纖維化，其是由兩個結(jié)扎之間橫切的雙結(jié)扎膽管組成[25]。術后7～10 d，膽管狹窄，膽管壓力升高，膽管上游擴張，造成肝體積增大，膽管增生[26]。有研究發(fā)現(xiàn)，除了HSC 在纖維形成中的相關作用外，門靜脈纖維化可能是活躍的門靜脈成纖維細胞產(chǎn)生的。后者可能通過白細胞介素-13 激活造血干細胞形成該模型中的MFB[27]。一般來說，膽總管結(jié)扎后，由于膽漏、膽囊炎或膽囊破裂，可能導致實驗動物死亡率高，所以適用于短期研究，難以廣泛推廣。

2.4 遺傳修飾小鼠模型

2.4.1 foz/foz 小鼠 foz/foz 小鼠具有一個突變的Alms1 基因，采用高脂飼料繼續(xù)喂養(yǎng)，foz/foz 小鼠會出現(xiàn)脂肪限制，促進脂質(zhì)流向肝臟和血清脂聯(lián)素水平下降，膽固醇水平升高，導致脂肪炎癥、肝細胞損傷，繼而向更嚴重的纖維化發(fā)展[20]。該模型依賴于飲食和基因修飾的相互作用，從而促進肝損傷。因此，實驗表明，喂食高脂飼料時，這些動物表現(xiàn)出過度肥胖、胰島素抵抗和嚴重的肝炎，還會伴有明顯的肝纖維化[28]。

2.4.2 db/db、ob/ob 小鼠 db/db 小鼠是瘦素受體點突變導致瘦素信號通路障礙，致小鼠出現(xiàn)肥胖、胰島素抵抗、高血糖、脂肪肝等癥狀。db/db 小鼠高脂肪喂養(yǎng)5 周后，出現(xiàn)明顯的肥胖和脂肪性病變。其白色脂肪組織的特征是氧化應激相關基因表達增加、巨噬細胞浸潤、脂聯(lián)素減少和脂質(zhì)代謝受損[29]。db/db 和ob/ob 小鼠的優(yōu)勢是其表型在很多方面都能模擬人類代謝綜合征，缺點在于它們不會自發(fā)形成非酒精性脂肪性肝炎和肝纖維化。

2.5 基于感染的模型

由于與人類感染的高度相似和高重現(xiàn)性，血吸蟲病是一種具有傳染性的寄生蟲感染疾病，由血吸蟲尾蚴感染宿主，引起肝細胞的損傷的人與動物共患疾病[30]。蟲卵在肝臟沉積，刺激體內(nèi)的免疫反應激活HSC，使HSC 迅速積累，造成炎性肉芽腫，其外圍由MFB 和膠原纖維過度沉積的纖維圍繞，最終形成肝纖維化[31]?？讘c明等[32]運用小鼠感染血吸蟲尾蚴建立肝纖維化動物模型，應用HE 染色和Masson 染色評估肝臟纖維化，顯示16 周后模型建立成功。但需要注意的是血吸蟲是人與動物均可感染的，所以對實驗室操作要求較高，保證操作研究者的自身安全。

3 小結(jié)與展望

肝纖維化是肝損傷后持續(xù)愈合的結(jié)果，該病的進展通常與肝炎病毒感染、酗酒和非酒精性脂肪性肝病有關。迄今為止唯一可用的治療方法是肝移植，然而受到治療費用高和肝捐贈者數(shù)量有限的阻礙，因此迫切需要找到臨床治療有效的方法。建立可靠穩(wěn)定的動物模型對研究人類肝纖維化有著極大的幫助，能夠幫助研究人員進行肝纖維化的機制和抗纖維化新藥的開發(fā)研究。優(yōu)秀的動物模型應該能最大限度地重現(xiàn)疾病發(fā)展的過程，同時應具有良好的可重復性和穩(wěn)定性。綜上所述，現(xiàn)階段的動物模型可以模擬不同病因所引起肝纖維化，但還不能完全代替人體用來進行疾病的發(fā)展和治療研究。隨著不斷深入的研究探索，將會建立出能夠模擬整個病程病機和藥物篩選的優(yōu)秀動物模型。