副豬嗜血桿菌與PCV3 混合感染的實驗室診斷及分析

趙自亮，田宇森，莊鴻琨，李婕，朱桓奕，劉霞，楊曉偉，，張立武，趙光偉，

（1.西南大學動物醫學院，重慶 402460；2.貴州省動物疫病預防控制中心，貴州貴陽 550008；3.重慶三杰眾鑫生物工程有限公司，重慶 402460）

副豬嗜血桿菌病也稱格拉澤氏病（Glasser's disease）[1]，是養豬業中影響較為嚴重的細菌性傳染病之一，臨床上往往與其他呼吸系統疾病或免疫抑制性疾病病原，如豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、圓環病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）等發生混合感染，單獨感染時則以豬多發性纖維素性漿膜炎和關節炎為特征，呈現出高發病率、高死亡率特點[2]。該病由隸屬巴氏桿菌科嗜血桿菌屬的副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，Hps）引起。Hps 無鞭毛和芽孢，為革蘭陰性短小桿菌，目前已發現15種血清型[3]。不同Hps血清型毒力差異較大，交叉保護力較低，且不同時空分離菌株的主要生物學特性存在較大差異，因而盡管目前有防控該病的商品化疫苗，但其預防效果存在地區差異。臨床上，抗生素仍是當前防治副豬嗜血桿菌病的主要手段，但長期不合理地用藥造成的耐藥問題較為突出。

豬圓環病毒（porcine circovirus，PCV）屬于圓環病毒科圓環病毒屬的閉合單股環狀DNA 病毒，有多種血清型，其中PCV3 于2016 年首次在患有皮炎腎病綜合征的母豬及流產胎兒的組織病料中被檢出[4]，隨后世界范圍內陸續報道發現該病毒。我國在遼寧、江西和重慶等地也檢測到PCV3[5]。現有資料表明，PCV3 單獨感染會導致壞死性心肌炎、間質性肺炎以及輕度的淋巴細胞性肝炎及免疫器官淋巴細胞消耗型炎癥等，與斷奶仔豬多系統衰弱綜合征（PMWS）癥狀較為相似[6]。盡管PCV3 分離困難，但通過病毒拯救獲得的PCV3 病毒粒子可以導致4 周齡和8 周齡仔豬產生與豬皮炎與腎病綜合征（PDNS）相似的臨床癥狀[7]，因而PCV3 的致病性不容忽視。鑒于對PCV3 感染尚無商品化疫苗及治療藥物，目前對其防控仍是一大難點。

本研究對重慶市某豬場發生的表現發熱和呼吸道癥狀的疫病進行實驗室診斷，確定為Hps 和PCV3 的混合感染，進而對Hps 分離株的主要生物學特征以及PCV3 的基因組特征進行了分析，以期為這兩種病原混合感染的臨床綜合防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料及發病情況

重慶市某豬場（存欄基礎母豬300 頭）育肥豬中出現以發熱和呼吸道癥狀為典型特征的疾病，發病率約為25%，死亡率約為20%；剖檢病死豬發現，肺臟有纖維素膜覆蓋，出血、腫脹明顯，心包內有大量積液。無菌采集病死豬心包液和肺臟組織至冰盒中，低溫迅速送至實驗室檢測。

1.2 主要試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、胰酪大豆胨液體培養基（TSB）、細菌微量生化反應管及藥敏紙片，購自杭州微生物試劑有限公司；特級胎牛血清（FBS）和一管式臨床樣品DNA 抽提試劑盒，購自上海生工生物工程股份有限公司；EasyPure Viral DNA/RNA Kit，購自北京全式金生物技術有限公司；反轉錄酶、2×RapidTaqMaster Mix 和DL 2 000 Plus DNA Marker，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；引物合成及測序，均在北京六合華大基因重慶分公司完成。

1.3 病料PCR 檢測

根據臨床表現及剖檢病理變化，參考已發表的RT-PCR 或PCR 方法，對組織病料進行傳染性胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，App）[8]、Hps[9]、豬瘟病毒（CSFV）[10]、PRRSV[11]、豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mps）[12]、PCV2 和PCV3[13]等 病原的核酸檢測。病料組織勻漿后，利用EasyPure Viral DNA/RNA Kit 提取核酸，其中提取的DNA用于App、Hps、Mps、PCV2 和PCV3 檢測，提取的RNA 經反轉錄后用于CSFV 和PRRSV 檢測。病原檢測及PCV3 全長擴增用引物序列、目的片段大小及退火溫度等見表1。

表1 病原檢測及PCV3 全長擴增用引物信息

1.4 細菌分離

用接種環無菌鉤取肺臟深層組織以及心包液接種兔血TSA 平板，置于37 ℃恒溫培養箱中，5% CO2厭氧培養24～48 h，觀察細菌生長狀況及菌落特征，挑取單個菌落進行二次純化培養36～48 h；將純化后的單個菌落接種于含有5%胎牛血清（FBS）的TSB 培養基中進行擴培，革蘭氏染色后鏡檢觀察其形態，后加無菌甘油凍存于-80 ℃備用。

1.5 16S rDNA 測序鑒定及同源性分析

利用一管式臨床樣品DNA 抽提試劑盒提取純培養細菌基因組，參考焦振泉[14]報道的16S rDNA通用引物進行PCR 擴增；PCR 產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳純化后送華大基因科技有限公司測序，對測序結果利用NCBI 的Blast 功能進行比對，確定分離菌種類。

1.6 Hps 血清型鑒定

1.7 分離菌生長曲線繪制

將純化培養菌接種于含5% FBS 的TSB 中，37 ℃ 180 r/min 振蕩培養24 h；將上述菌液按1%的體積分數接種于含5% FBS 的5 mL 滅菌TSB 中，設3 個平行組，共15 組，以未接菌培養基作為空白對照，每隔2 h 取一組測定OD600nm，計算樣品與空白對照差值的平均值，連續測定30 h，繪制分離菌株生長曲線。

1.8 分離菌藥敏試驗

根據美國臨床檢驗標準委員會（NCCLS）推薦的Kriby-Bauer 紙片擴散法，對分離菌進行β-內酰胺類、氨基糖苷類和四環素類共23 種藥物的敏感性試驗，參照藥敏紙片說明書進行耐藥（R）、中介（I）和敏感（S）分析。具體步驟：取分離菌純化培養物調整菌液濃度為0.5 麥氏比濁度，均勻涂布于兔血TSA 平板，培養36 h，測量并記錄抑菌圈直徑。

1.9 分離菌耐藥基因檢測

對分離菌分別進行β-內酰胺類[17-20]、氨基糖苷類[21]和四環素類[22]藥物的49 種常見耐藥基因進行檢測分析，其中β-內酰胺類包括blaTEM、blaCTX-M、blaSHV、blaPER、blaSIM、blaDHA、blaADC、blaEBC、blaCIT、blaACC、blaCMY、blaMOX、blaFOX、blaPSE、blaIMP、blaVIM、blaOprD2、blaGES、blaMIR、blaISAbal、blaCARB、blaGIM、blaSPM、blaCMY-1、blaKPC-gp、blaNMC和blaACT-1共27 種，氨基糖苷類包括strA、strB、aadB、aac(3)-IV、aph3'-III、aacC2和aphA1共7 種，四環素類包括tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetK、tetL、tetM、tetO、tetS、tetZ、tet31、tet33和tet34共15 種。

1.10 PCV3 全基因組擴增與拼接

參考Fux 等[23]報道，合成3 對引物（表1）對病料進行3 段PCV3 基因組擴增；PCR 產物純化測序后，利用DNAstar 7.0 軟件進行拼接，獲得PCV3 全基因組序列，并將該序列信息上傳至GenBank。

1.11 PCV3 系統進化樹構建及基因型鑒定

將本試驗獲得的PCV3 基因組序列與國內22 個省份分離的及美國最早報道的毒株信息進行比較，參考毒株全序列包括PCV3a 基因型9 株（MH177453、MH823221、MK105924、M K 1 7 8 2 9 7、M K 1 7 8 3 2 0、M T 2 2 8 7 0 3、OK334614、OL422143、KT869077），PCV3b 基因型5 株（MH607133、MK142773、MK178285、MN605937、MN790776），PCV3c 基因型9株（KY075990、MF072716、MG372486、MG564175、MH683051、MK656956、MN507536、MZ934695、MZ449237）；利用MEGA 7 軟件構建系統進化樹，進行基因型鑒定。

2 結果

2.1 臨床剖檢

臨床剖檢患病豬，可見心包中有大量渾濁積液（圖1-A），并混有血液；肺臟表面被乳白色纖維素性膜覆蓋（圖1-B），并與胸腔發生粘連，剝去被膜后肺臟出血、腫脹明顯。

圖1 發病豬剖檢結果

2.2 病料PCR 檢測

PCR 檢測結果（圖2）顯示，病料樣本中Hps和PCV3 兩種病原均為陽性，其余5 種病原（App、PCV2、CSFV、PRRSV 和Mps）均為陰性。

對所選用的太陽能電池組件和蓄電池，有必要對它們的設計進行校核，以進一步了解系統運行中可能出現的情況，保證太陽能電池組件和蓄電池可以有效、協調工作。

圖2 病料PCR 檢測結果

2.3 分離菌培養及形態特征

病料接種兔鮮血瓊脂平板于37 ℃、5% CO2培養48 h 后，可見無色透明、邊緣整齊、光滑濕潤的圓形小菌落，菌落周圍有溶血環（圖3-A）；純培養的細菌為革蘭氏陰性，多單個存在，呈球狀、短桿狀，部分以短鏈排列，呈絲狀排布（圖3-B）。

圖3 分離菌培養及形態結果

2.4 分離菌16S rDNA 基因擴增及進化樹分析

分離菌的16S rDNA 擴增結果見圖4-A。測序后經Blast 比對，該菌與Hps 江西株（JN031031）同源性為100%（圖4-B），可以確定分離菌為Hps，將其命名為YY-1。該序列已上傳GenBank，登錄號為ON645281。YY-1 與貴州、湖南、云南的Hps 菌株同源性較高，但與四川、江蘇的同源性較低，說明Hps 在我國存在一定地域差異。

圖4 YY-1 株16S rDNA 基因PCR 擴增結果及其與巴氏桿菌科主要成員的同源性比較結果

2.5 YY-1 菌株生長曲線

Hps YY-1 株生長曲線測定結果（圖5）顯示，該菌0～4 h 內生長較為緩慢，4 h 后上升趨勢明顯，10～14 h 上升最為顯著，為該菌的對數生長期，18 h 后吸光值（OD600nm）趨于平緩，進入平臺期。

圖5 YY-1 株在TSB 培養基中的生長曲線

2.6 YY-1 菌株血清型鑒定

利用PCR 方法對YY-1 菌株進行血清學鑒定，結果發現該菌血清5 型wcwk基因擴增出450 bp 的目的條帶，與預期相符，經測序比對確定YY-1 菌株為血清5 型（圖6）。

圖6 YY-1 菌株血清型鑒定結果

2.7 YY-1 菌株藥敏試驗

藥敏結果顯示：YY-1 菌株對頭孢他啶、苯唑西林、新霉素、卡那霉素、氯霉素、米諾環素、多黏菌素B 和四環素表現為耐藥，對頭孢氨芐、丁胺卡那、氟苯尼考表現為中介，對頭孢曲松、氨芐西林、羧芐西林、青霉素、頭孢唑林、頭孢哌酮、頭孢呋辛、頭孢拉定和多西環素等藥物表現為敏感。

2.8 YY-1 菌株耐藥基因檢測

PCR 檢測結果顯示：YY-1 菌株中含有9 種耐藥基因，分別是β-內酰胺類耐藥基因blaVIM、blaISAbal、blaCARB和blaCMY-1（圖7-A、B），氨基糖苷類耐藥基因aadB（圖7-C）和四環素類耐藥基因tetB、tetK、tetM、tetO（圖7-D）

圖7 YY-1 株β 內酰胺類、氨基糖苷類、四環素類耐藥基因檢測結果

2.9 PCV3 全基因組擴增

以送檢樣本提取的DNA 為模板進行PCV3 分段擴增。結果（圖8）顯示：經測序拼接，PCV3全基因組全長2 000 bp，GC 含量為50.45%；主要開放閱讀框ORF1（216～1 106 nt）編碼的復制酶蛋 白（replication-associated protein）共296 aa，ORF2（1 336～1 980 nt）編碼的衣殼蛋白（capsid protein），共214 aa；ORF1 無經典起始密碼子ATG，且ORF2 與ORF1 編碼方向相反。將其命名為PCV3-CQ-YunYang，序列信息上傳GenBank（登錄號：ON505646）。

圖8 PCV3-CQ-YunYang 株全基因組擴增結果

2.10 PCV3 全基因組系統進化樹及基因型分析

系統進化樹（圖9）顯示：本試驗分離毒株與吉林MK178320 株位于同一分支，具有最高的同源性；與廣西MH823221 株和美國最早報道的KT869077 株也具有較高的親緣關系。基于Cap 蛋白氨基酸序列24/27 位點分型方法，確定本試驗分離毒株為3a 基因型。

圖9 PCV3-CQ-YunYang 全基因組序列與參考毒株系統進化樹

3 討論

多病原混合感染是當前豬病的典型特征之一，引起的癥狀更加復雜，僅憑臨床表現往往無法準確判斷其病因，需借助實驗室手段嚴格檢驗并與臨床結合方能得出準確結果。本試驗中豬場發生的病情也符合這一點，剖檢結果與多種病原感染較為相似，單靠肉眼觀察并不能確定病因，因而實驗室診斷十分必要。此外，一些新興的診斷技術和方法應在臨床中廣泛推廣，這樣有利于提升診斷效率，迅速確定病因，從而降低經濟損失。

Hps 是豬場中常見的細菌性病原，利用分子生物學技術可將其分為1～15 個血清型，其中1、5、10、12、13、14 型為高毒力型，2、4、8、15 型為中等毒力型，3、6、7、9、11 型為無毒力型[3]。根據以往的報道，2007—2014 年我國的優勢血清型為2、4、5、12、13 型[24]，2014—2020 年為4、5、7、13、14 型[25]，2020—2021 年為4、5、12、13 型[26]，可以看出4、5、13 型是在我國長期流行的優勢血清型。本試驗自重慶市分離到的YY-1 菌株，經鑒定為血清5 型，與上述報道的優勢血清型一致。

Hps 另一個不容忽視的問題是耐藥性嚴重。盡管目前已有針對Hps 的商品化疫苗（2 價、3 價、4 價），但由于在使用過程中往往并不清楚養殖場流行的優勢菌株血清型，容易造成免疫失敗，因而很多養殖場仍主要采用抗生素進行預防和治療，導致菌株耐藥現象非常普遍。孫華潤等[27]對河南、湖北、湖南、山西、陜西、安徽和江西等7 個省份分離的104 株Hps 進行藥敏試驗發現，菌株對β內酰胺類氨芐西林耐藥率為39.4%，對四環素、環丙沙星耐藥率分別為51.9%和51.0%，對氨基糖苷類卡那霉素耐藥率為10.6%，使得養殖場有效防控Hps 感染的藥物逐漸減少。本試驗分離的YY-1 菌株對多數的頭孢類藥物仍表現為敏感，但對氨基糖苷類和四環素類藥物敏感性較差，并表現出較強的耐藥性；隨后的耐藥基因檢測結果也與之基本相符，頭孢類耐藥基因共檢出blaVIM、blaISAbal、blaCARB和blaCMY-1，四環素類耐藥基因（tetB、tetK、tetM、tetO）和氨基糖苷類耐藥基因aadB均有檢出，這也充分暴露出Hps 耐藥嚴重的問題。

PCV3 是近幾年剛發現但其實早已在豬場流行的，與PMWS、PDNS 等密切相關的病毒，目前對該病毒致病性研究的報道較少，主要是因為PCV3分離困難。研究人員曾嘗試將陽性病料接種到傳代細胞系PK15 和ST 細胞中，但由于不出現細胞病變而導致分離失敗[4]。盡管如此，PCV3 的致病性不容忽視。呂志凱等[6]對PCV3 自然感染仔豬病例進行病理學研究發現，PCV3 單獨感染病豬呈現典型的PMWS 癥狀，且病毒主要位于單核和巨噬細胞胞質中；Jiang 等[7]研究發現，通過病毒拯救獲得的PCV3 病毒粒子可使仔豬產生PDNS 癥狀。因而對PCV3 臨床感染病例進行研究是必要的。本研究中的患病豬由于是PCV3 和Hps 的混合感染，比單獨感染引起的癥狀更為復雜。

基于PCV3 Cap 蛋白第24 位和27 位氨基酸差 異，將PCV3 基因型分為PCV3a、PCV3b 和PCV3c。本試驗檢測到的病毒屬于3a 亞型，其第24 位和27 位氨基酸分別為丙氨酸（A）和精氨酸（R），這與2020 年在重慶市所檢測到毒株基因型一致[28]，說明PCV3a 可能是該地區的優勢基因型。

病原混合感染往往會導致比單一感染更加嚴重的后果。本病例也存在類似情況，其發病率和死亡率均高于單一病原感染，但Hps 與PCV3 在感染過程中是否是某一病原起主導作用，或者是先感染某一病原，而后繼發感染另一病原，其準確的感染機制有待于進一步研究。盡管如此，本研究對Hps和PCV3 的主要生物學特性進行了分析，其結果可為臨床疫病防控提供參考。