三種非洲豬瘟病毒熒光PCR 檢測(cè)試劑盒和兩種核酸提取方法的比對(duì)

曹東陽(yáng)，朱奕霏，馬曉媛，白翠，楊金鑫，胡澤宇，吳丹

（吉林省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，吉林長(zhǎng)春 130211）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病[1]，以高熱、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)出血以及高死亡率為特征。2018 年ASF 首次在我國(guó)暴發(fā)，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（WOAH）將其列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為一類(lèi)動(dòng)物疫病[2]。ASFV 能夠通過(guò)節(jié)肢動(dòng)物傳播，軟蜱是其重要的傳播宿主。為科學(xué)防控ASF，有效應(yīng)對(duì)該病引發(fā)的疫情，我國(guó)畜牧獸醫(yī)部門(mén)已建立了常態(tài)化監(jiān)測(cè)方案，并更新了多版防控指南。

目前尚缺乏有效防治ASF 的疫苗或藥物，因此精準(zhǔn)發(fā)現(xiàn)并剔除群體中的患病動(dòng)物尤為關(guān)鍵。常用的ASFV 檢測(cè)技術(shù)主要包括普通PCR、熒光PCR、高敏熒光免疫分析法、夾心ELISA 抗原檢測(cè)、間接/阻斷ELISA 抗體檢測(cè)、間接免疫熒光法等。其中，熒光PCR 技術(shù)因具備靈敏度高、檢測(cè)便捷、污染小等特點(diǎn)成為ASFV 病原學(xué)主流檢測(cè)方法。隨著ASFV 變異株的出現(xiàn)以及熒光PCR 檢測(cè)技術(shù)的普及，市面上的核酸提取和熒光PCR 診斷試劑不斷更新、完善，但由于變異毒株排毒量較低，一些提取效率低，擴(kuò)增敏感性和靈敏度差的試劑盒無(wú)法滿(mǎn)足實(shí)際檢測(cè)需求。如何選用合適的試劑產(chǎn)品開(kāi)展防疫工作，是豬場(chǎng)和獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)面臨的一項(xiàng)重要工作。

本試驗(yàn)分別選取3 個(gè)廠(chǎng)家的ASFV 熒光PCR檢測(cè)試劑盒和2 個(gè)廠(chǎng)家的核酸提取試劑盒，參照WOAH《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)》（2018年版）1.1.6 章[3]和GB/T 18648—2020 中ASFV 熒光PCR 部分推薦的程序要求，分別對(duì)提取和擴(kuò)增試劑盒的性能進(jìn)行比較分析，以期為各獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室ASFV 檢測(cè)試劑選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

3 個(gè)廠(chǎng)家的商品化ASFV 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒（A、B、C），均為國(guó)產(chǎn)；2 個(gè)廠(chǎng)家的核酸提取試劑盒（D、E），均為國(guó)產(chǎn)；B646L基因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，由哈爾濱獸醫(yī)研究所饋贈(zèng)，病毒載量為105copies/μL；豬瘟病毒（CSFV）、豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品各1 份，均購(gòu)自哈爾濱世紀(jì)元亨有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀CFX96（Bio-Rad，美國(guó)）、臺(tái)式冷凍離心機(jī)（Thermo fisher，美國(guó)）、PANA9600S 全自動(dòng)核酸工作站（西安天隆科技有限公司）、自動(dòng)化移液處理工作站（Hamilton，瑞士）。

1.3 方法

ASFV 熒光定量PCR 擴(kuò)增試劑評(píng)價(jià)分別從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、決定系數(shù)（R2）、最低檢出限（LOD）、特異性、反應(yīng)時(shí)間等方面進(jìn)行綜合評(píng)定；應(yīng)用ASFV 熒光PCR 檢測(cè)試劑盒，對(duì)2 個(gè)廠(chǎng)家的核酸提取試劑進(jìn)行測(cè)試，通過(guò)比較Ct 值評(píng)價(jià)核酸提取效果。

1.3.1 熒光定量PCR 試劑盒性能比較試驗(yàn) 對(duì)ASFVB646L基因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行10 倍梯度稀釋?zhuān)玫?05～102copies/μL 標(biāo)準(zhǔn)樣品，使用熒光PCR絕對(duì)定量方法構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，查看CFX ManagerTMSoftware 軟件自動(dòng)輸出的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率和R2，同時(shí)對(duì)每個(gè)試劑盒的反應(yīng)體系、反應(yīng)條件以及反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行比較。

1.3.2 熒光定量PCR 試劑盒最低檢出限（LOD）檢測(cè) 對(duì)ASFVB646L基因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行10 倍倍比稀釋得到103～10-3copies/μL 標(biāo)準(zhǔn)樣品，使用3 種熒光定量PCR 試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，統(tǒng)計(jì)不同廠(chǎng)家試劑盒對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品的LOD，評(píng)價(jià)試劑盒的敏感性。

1.3.3 熒光定量PCR 試劑盒特異性試驗(yàn) 使用3種ASFV 熒光定量PCR 試劑盒分別對(duì)DEPC 水以及CSFV、PCV2、PRRSV 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)。其中，每種試劑盒配置46 份DEPC 水，CSFV、PCV2、PRRSV 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品各3 個(gè)重復(fù)孔，統(tǒng)計(jì)不同試劑盒特異性檢測(cè)結(jié)果。

1.3.4 病毒核酸提取試劑盒評(píng)價(jià)試驗(yàn) 應(yīng)用D、E 2個(gè)廠(chǎng)家的核酸提取試劑分別對(duì)105和104copies/μL 的ASFV 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行核酸提取，選用B 廠(chǎng)家ASFV熒光定量PCR 核酸檢測(cè)試劑盒對(duì)提取的核酸進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)樣品做3 個(gè)重復(fù)，通過(guò)Ct 值比較不同試劑盒的核酸提取差異，并計(jì)算差異性和變異系數(shù)（CV）。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量PCR 試劑盒測(cè)評(píng)

2.1.1 性能比較 3 個(gè)廠(chǎng)家的ASFV 熒光PCR擴(kuò)增試劑盒反應(yīng)體系、條件、時(shí)間以及結(jié)果判定等見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，A 試劑盒反應(yīng)循環(huán)數(shù)為45，B、C 試劑盒為40；3 個(gè)廠(chǎng)家試劑檢測(cè)時(shí)間依次為C ＜B ＜A，其中A 試劑盒檢測(cè)時(shí)間最長(zhǎng)（105 min），B、C 試劑盒檢測(cè)時(shí)間分別為58和56 min；3 個(gè)廠(chǎng)家試劑所需模板含量依次為B ＜C ＜A，其中B 試劑盒所需模板量最少（0.5 μL），A、C 試劑盒所需模板量分別為2.0 和1.0 μL；A 試劑盒結(jié)果判定中樣品Ct ≤38 為陽(yáng)性，而B(niǎo)、C 試劑盒樣品Ct ≤35 為陽(yáng)性。對(duì)3 個(gè)試劑盒比較發(fā)現(xiàn)，A試劑盒循環(huán)數(shù)最多，反應(yīng)時(shí)間最長(zhǎng)，其較B、C 兩款試劑盒應(yīng)用更為廣泛。

表1 3 個(gè)廠(chǎng)家ASFV 實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)試劑盒測(cè)評(píng)結(jié)果

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 對(duì)4 個(gè)稀釋梯度（105～102copies/μL）的ASFV 核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別選用3 個(gè)廠(chǎng)家的ASFV 熒光PCR 試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，最終得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，每個(gè)梯度樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。結(jié)果（圖1）顯示，受測(cè)試劑盒A、B、C 的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率分別為-2.691、-2.721、-2.675，R2分別為0.985、0.996、0.985，結(jié)果均較為理想。

圖1 A、B、C 廠(chǎng)家熒光PCR 試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和擴(kuò)增曲線(xiàn)

2.1.3 最低檢出限（LOD）對(duì)ASFV 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行7 個(gè)梯度的倍比稀釋?zhuān)?03～10-3copies/μL），使用3 個(gè)廠(chǎng)家的ASFV 熒光定量PCR 試劑盒進(jìn)行測(cè)試，每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。結(jié)果（表2）顯示，B、C 試劑盒LOD 為10-1copies/μL；A 試劑盒LOD 為10-2copies/μL，且樣品重復(fù)性較好。

表2 3 個(gè)廠(chǎng)家ASFV 熒光PCR 試劑盒LOD 測(cè)評(píng)結(jié)果

2.1.4 特異性試驗(yàn) 結(jié)果（圖2）顯示，除陽(yáng)性對(duì)照外，A、B、C 3 種ASFV 熒光PCR 試劑盒對(duì)DEPC 水以及CSFV、PCV2、PRRSV 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)均未得到Ct 值和“S”型擴(kuò)增曲線(xiàn)，表明這3種ASFV 熒光PCR 試劑盒的特異性均較好。

圖2 3 個(gè)廠(chǎng)家ASFV 熒光PCR 試劑盒特異性檢測(cè)結(jié)果

2.2 核酸提取試劑盒測(cè)評(píng)

選用B 廠(chǎng)家試劑對(duì)兩個(gè)稀釋梯度（105和104copies/μL）的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行核酸提取試劑測(cè)評(píng)。結(jié)果（表3）顯示：手工柱式核酸提取和核酸提取工作站磁珠提取法檢測(cè)的Ct 值相近，105copies/μL標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的Ct 值均在21.00 以上，104copies/μL 的Ct 值均在24.00 以上，兩種提取方法在ASFV 擴(kuò)增結(jié)果中Ct 值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.1），試劑盒重復(fù)性較好，批內(nèi)變異系數(shù)可控制在1.5%以?xún)?nèi)。

表3 不同核酸提取方法提取效率比較結(jié)果

3 討論

自1921 年ASFV 在肯尼亞被首次報(bào)道以來(lái)，其影響范圍遍布非洲、西歐、拉丁美洲等地區(qū)以及西班牙、意大利等國(guó)家，并逐步從歐洲擴(kuò)散蔓延至亞洲。據(jù)報(bào)道[4]，2022 年泰國(guó)、韓國(guó)、德國(guó)以及印度均有ASF 陽(yáng)性病例。2018 年以后，我國(guó)一直將ASFV 檢測(cè)作為豬場(chǎng)管理和常態(tài)化監(jiān)測(cè)的重要項(xiàng)目。

熒光PCR 技術(shù)作為盡早發(fā)現(xiàn)和確診ASF 的重要技術(shù)手段，在當(dāng)前疫病防控中發(fā)揮著重要作用。隨著檢測(cè)技術(shù)發(fā)展，ASFV 熒光PCR 檢測(cè)試劑盒和核酸提取試劑也出現(xiàn)了換代更新，且不同廠(chǎng)家的檢測(cè)/提取試劑也各有優(yōu)缺點(diǎn)。因此對(duì)熒光PCR試劑盒和核酸提取試劑盒的性能評(píng)價(jià)就顯得尤為重要。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品，是一種能夠作為參照對(duì)象的特定、均勻、穩(wěn)定且濃度/病毒含量已知的質(zhì)量控制品，在儀器設(shè)備的校準(zhǔn)、能力驗(yàn)證以及期間核查等項(xiàng)目中廣泛應(yīng)用。許秀瓊等[5]將ASFV 核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)不同廠(chǎng)家的ASFV 熒光PCR 檢測(cè)試劑盒進(jìn)行了比對(duì)分析；馬龍等[6]也使用ASFV 病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，評(píng)價(jià)了市面上5 種主流品牌的ASFV熒光定量PCR 試劑盒的檢測(cè)性能；黃維等[7]通過(guò)ASFV 熒光PCR 試劑盒對(duì)常用的核酸提取方式進(jìn)行了比較。上述均證明了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在試劑盒比對(duì)中的可靠性，因此本試驗(yàn)應(yīng)用ASFV 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)3 個(gè)廠(chǎng)家的ASFV 熒光PCR 試劑盒和兩種不同核酸提取試劑進(jìn)行比較評(píng)估。ASFV 熒光PCR 試劑盒綜合性能評(píng)定中，B 試劑盒R2為0.996，表現(xiàn)最佳，A、C 試劑盒均為0.985。試劑評(píng)定中R2大于0.985 即為優(yōu)秀，證明3 個(gè)廠(chǎng)家試劑盒的R2均較為理想。

研究[8]顯示，熒光PCR 檢測(cè)方法檢出下限為6 個(gè)質(zhì)粒拷貝或0.1～1.0 TCID50/mL，是實(shí)現(xiàn)病毒精準(zhǔn)剔除的最佳方法。并且，診斷試劑的敏感性越高，檢測(cè)患病動(dòng)物的陽(yáng)性結(jié)果概率越高，而假陰性結(jié)果隨之越少[9]。3 個(gè)廠(chǎng)家ASFV 熒光PCR 試劑盒的LOD 介于10-1～10-2copies/μL，且均出現(xiàn)Ct 值和擴(kuò)增曲線(xiàn)，說(shuō)明3 種試劑盒檢測(cè)靈敏度均可滿(mǎn)足日常監(jiān)測(cè)需求。其中，A 試劑盒反應(yīng)循環(huán)數(shù)在3 個(gè)廠(chǎng)家中最多且反應(yīng)時(shí)間最長(zhǎng)，LOD 為10-2copies/μL，靈敏度最高，推斷A 試劑更適用于臨床含毒量低的樣品檢測(cè)。特異性檢測(cè)中，3 個(gè)廠(chǎng)家試劑盒均未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增曲線(xiàn)和Ct 值，證明3 種試劑盒均具備良好的ASFV 檢測(cè)特異性。核酸提取試劑盒測(cè)試結(jié)果顯示，工作站磁珠法和手提柱式核酸提取法均可滿(mǎn)足提取病毒核酸的需求，兩核酸提取試劑盒的Ct 值重復(fù)性較好，批內(nèi)變異系數(shù)可控制在1.5%以?xún)?nèi)。手提試劑盒價(jià)格較低，但隨著樣品數(shù)量增多提取時(shí)間延長(zhǎng)，加溶液過(guò)程中易出現(xiàn)樣品間的交叉污染；全自動(dòng)核酸提取工作站提取試劑為預(yù)分裝、提取時(shí)間固定、操作簡(jiǎn)便，但價(jià)格較手工提取試劑略顯昂貴。

本試驗(yàn)利用ASFV 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)評(píng)價(jià)了3 種ASFV熒光PCR 檢測(cè)試劑盒和兩種核酸提取方法，各檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室在實(shí)際工作中也應(yīng)在保證試劑盒重復(fù)性的前提下，根據(jù)試劑盒的檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)、模板需求、檢測(cè)敏感性、提取方式以及經(jīng)濟(jì)效益等因素靈活選擇適配試劑。因局限于樣品的單一性，本試驗(yàn)未選用臨床不同感染階段的動(dòng)物或不同感染部位的樣品用于測(cè)試，在今后的研究中也將聚焦于多種臨床樣品的收集和測(cè)試，并擴(kuò)大試劑盒的選用范圍，進(jìn)一步完善檢測(cè)試劑的比對(duì)方法并積累相關(guān)數(shù)據(jù)。