一例由糞腸球菌感染引起的鴨死亡病例診斷

劉 云，徐小艷，陳昌海，邱冬，董永毅，羊揚(yáng)

（1.江蘇省動物疫病預(yù)防控制中心，江蘇南京 210036；2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225000）

糞腸球菌（Enterococcus faecalis，E.faecalis）是一種廣泛存在于動物腸道的條件致病菌，屬于兼性厭氧革蘭氏陽性菌，同時也是人獸共患病原菌之一[1]。糞腸球菌會導(dǎo)致禽敗血癥及腹瀉等癥狀[2]，不僅危害動物健康，還威脅人類公共衛(wèi)生安全[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌已逐漸成為人獸共患病原菌中的第二大革蘭氏陽性菌[4]，在醫(yī)院分離出的致病菌中，糞腸球菌排名前三[5]。2022 年3 月，江蘇省某養(yǎng)殖戶飼養(yǎng)的青年鴨突然出現(xiàn)不明原因發(fā)病和死亡。研究人員對病例進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查和臨床剖檢，并采集病料進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢測，證實(shí)該起死亡病例是由糞腸球菌感染引起。本研究為進(jìn)一步探究糞腸球菌感染的診斷和防治提供了技術(shù)支撐。

1 流行病學(xué)調(diào)查及剖檢病變

該養(yǎng)殖戶共飼養(yǎng)鴨1 800 只，調(diào)查時現(xiàn)欄存鴨中仍有發(fā)病鴨13 只。經(jīng)現(xiàn)場查看，鴨場附近有池塘，飼養(yǎng)環(huán)境不佳。據(jù)農(nóng)戶口述，鴨群在21 日齡時接種過重組禽流感病毒（H5+H7）三價(jià)滅活疫苗。鴨群在調(diào)查1 周前開始發(fā)病，病鴨表現(xiàn)為歪頭斜頸、食欲不振，后期有綠色稀便，當(dāng)天死亡2 只，另有3 只呈神經(jīng)癥狀。現(xiàn)場剖檢病鴨5 只，發(fā)現(xiàn)肝臟呈腫大、質(zhì)地變脆、有纖維素性滲出物等病理變化。

2 實(shí)驗(yàn)室診斷

2.1 主要試劑與儀器

麥康凱瓊脂平板、營養(yǎng)肉湯、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）、綿羊血平板、革蘭氏染色液、DNA/RNA 提取試劑盒、禽流感病毒實(shí)時熒光RT-PCR 檢測試劑盒、全自動微生物分析系統(tǒng)、MALDI Biotyper 全自動快速生物質(zhì)譜儀、生物安全柜、恒溫培養(yǎng)箱等。

2.2 病料采集

無菌采集1 例發(fā)病死亡鴨心臟，用無菌袋密封后放于采樣箱中，并盡快送回實(shí)驗(yàn)室，置于-20 ℃冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 實(shí)驗(yàn)室檢測

2.3.1 禽流感病毒檢測 取病變明顯的心臟樣品1 份，經(jīng)充分研磨后離心取上清，按照RNA 提取試劑盒說明書提取病毒RNA，按照禽流感病毒實(shí)時熒光RT-PCR 檢測試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，對樣本RNA 進(jìn)行檢測，同時設(shè)立陰、陽性對照。

2.3.2 細(xì)菌分離 火焰灼燒接種環(huán)后插入樣品組織內(nèi)部，無菌沾取組織液，劃線接種于綿羊血平板和麥康凱瓊脂平板，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；挑取形態(tài)特征一致的單個菌落再次接種于上述兩種培養(yǎng)基，觀察菌落生長情況和形態(tài)特征；至細(xì)菌生長狀態(tài)穩(wěn)定且良好后，挑取單菌落接種于TSB 或血平板中增殖備用[6-7]。

2.3.3 染色鏡檢 挑取培養(yǎng)板上的典型單菌落涂抹于載玻片上，按照革蘭氏染色說明書要求，對細(xì)菌實(shí)施染色，鏡檢觀察染色結(jié)果，并結(jié)合細(xì)菌生長特性和染色結(jié)果進(jìn)行初步判定。

2.3.4 全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定 根據(jù)染色鏡檢結(jié)果，參照全自動微生物分析系統(tǒng)SOP，選擇相應(yīng)的鑒定卡片；同時按照操作指南的培養(yǎng)要求對鏡檢細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，配置菌懸液并且調(diào)整為合適的菌液濃度后，進(jìn)行全自動微生物分析鑒定。

2.3.5 微生物質(zhì)譜鑒定 挑取單菌落涂抹于金屬鑒定板上，滴加1 μL 70%甲酸晾干后，滴加1 μL 基質(zhì)溶液；將金屬鑒定板放入真空倉，應(yīng)用MALDI Biotyper微生物快速鑒定質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定。

2.3.6 16SrDNA測序按照DNA提取試劑盒說明書提取細(xì)菌DNA，擴(kuò)增16S rDNA 基因進(jìn)行測序。16S rDNA 的通用上游引物為5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，下游引物為5'-GGCTACCTTGTTACGACT-3'。PCR 擴(kuò)增體系及反應(yīng)程序參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性PCR 產(chǎn)物連接載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)，將鑒定為陽性的重組菌液送至生物公司測序，并將所得序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對分析。

2.3.7 雛鴨致病性試驗(yàn) 將10 只1 日齡雛鴨飼養(yǎng)3 d 后隨機(jī)分成兩組，每組5 只。試驗(yàn)組采取肌肉注射方式接種預(yù)制的細(xì)菌懸液0.2 mL/ 只（7.0 ×108CFU/mL）；對照組雛鴨采取相同的方式注射TSB 0.2 mL/只。兩組雛鴨接種后放于同等條件下進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)，觀察記錄發(fā)病死亡情況。

3 結(jié)果

3.1 禽流感病毒檢測

結(jié)果（圖1）顯示，陰、陽性對照均成立，而待測樣品無Ct值，說明樣品為禽流感病毒核酸陰性。

圖1 禽流感病毒熒光定量RT-PCR 檢測結(jié)果

3.2 細(xì)菌分離

從心臟中分離的細(xì)菌經(jīng)過37 ℃恒溫過夜培養(yǎng)后，在綿羊血平板上呈灰白色、不透明、表面光滑的菌落（圖2-A），在麥康凱瓊脂平板上不生長[9]（圖2-B）。

圖2 菌落培養(yǎng)形態(tài)

3.3 染色鏡檢

結(jié)果（圖3）顯示，在顯微鏡下，細(xì)菌染色后呈紫色，圓形或橢圓形，呈鏈狀或成對排列。

圖3 染色鏡檢形態(tài)

3.4 全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定

將鑒定卡片放入全自動微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，經(jīng)對照VITEK 2 Systems 細(xì)菌鑒定目錄，確認(rèn)分離的細(xì)菌為糞腸球菌（圖4）。

圖4 全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定結(jié)果

3.5 微生物質(zhì)譜鑒定

將待測的指紋圖譜與菌種庫中的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行比對，分?jǐn)?shù)＞2.0，代表結(jié)果可靠[10]，確認(rèn)分離的細(xì)菌為糞腸球菌（圖5）。

圖5 微生物質(zhì)譜鑒定結(jié)果

3.6 16S rDNA 測序

結(jié)果（圖6）顯示，目的條帶大小約1 426 bp。將擴(kuò)增產(chǎn)物與糞腸球菌參考株（GenBank 登錄號為MN833019.1）進(jìn)行序列比對，同源性達(dá)99.86%。

圖6 16S rDNA 擴(kuò)增結(jié)果

3.7 雛鴨致病性試驗(yàn)

試驗(yàn)組雛鴨接種菌液3 d 后，有2 只出現(xiàn)臨床癥狀，主要表現(xiàn)為精神沉郁、不思飲食、羽毛蓬亂、喜臥惡動、扎堆昏睡、眼瞼渾濁、排綠色稀便；接種后5 d，試驗(yàn)組5 只鴨均發(fā)病，至14 d 試驗(yàn)結(jié)束時，1 只鴨死亡。對照組雛鴨在觀察期內(nèi)均正常活動，無發(fā)病死亡現(xiàn)象。剖檢發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組雛鴨心臟和肝臟有輕微的纖維素性滲出。

4 防治措施

4.1 加強(qiáng)日常飼養(yǎng)管理

預(yù)防糞腸球菌感染要提高鴨群的飼養(yǎng)管理水平，消除發(fā)病誘因。重視飼料和飲水的清潔衛(wèi)生，根據(jù)鴨群的生長階段、發(fā)育情況等科學(xué)配比飼料，尤其是要控制好微量元素、礦物質(zhì)、維生素等成分，提高群體抵抗力。合理控制飼養(yǎng)密度，使飼養(yǎng)密度不超過10 只/m2。配備智能溫控系統(tǒng)或安裝溫濕度感應(yīng)器，監(jiān)測并調(diào)整欄舍內(nèi)溫濕度。做好欄舍通風(fēng)換氣工作，有效降低有毒有害氣體（如氨氣）濃度。加強(qiáng)消毒，使用0.2%～0.5%的過氧乙酸水溶液對墊料、籠框、場地等進(jìn)行噴灑消毒等。

4.2 做好生物安全防控

把好引種關(guān)，經(jīng)檢疫合格后引進(jìn)健康鴨群，做到不從疫區(qū)引種，防止引入疫病，引進(jìn)的雛鴨隔離飼養(yǎng)15～30 d 后，再混群飼養(yǎng)。隔離傳染源，對來往車輛以及場區(qū)周邊環(huán)境、工作人員的隨身物品等展開嚴(yán)格消毒，限制外來人員進(jìn)入養(yǎng)殖區(qū)域。杜絕鳥、鼠等動物與鴨群接觸。

4.3 科學(xué)合理用藥

糞腸球菌感染屬于細(xì)菌性疫病，抗生素治療有一定效果。臨床上糞腸球菌對多種抗生素敏感，例如紅霉素、新霉素以及頭孢類藥物等，用藥前建議先進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。本病例使用硫酸新霉素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%～0.02%，連飲3 d）進(jìn)行飲水治療，同時對重癥病鴨用慶大霉素（3 000～5 000 國際單位/kg）加阿莫西林（20～50 mg/kg）混合注射，1 次/d，連用3 d。采取上述防治措施6 d 后，鴨群恢復(fù)健康。

5 討論

本病例發(fā)病突然，為此研究人員首先采集病料進(jìn)行了禽流感病毒實(shí)時熒光RT-PCR 檢測，排除了禽流感。糞腸球菌的某些菌株會引發(fā)禽敗血癥及腹瀉等癥狀[11-12]，在臨床上很容易與鴨傳染性漿膜炎、鴨流感、鴨病毒性肝炎混淆。鴨傳染性漿膜炎患鴨一般兩腿無力、無法站立，頭頸亂擺，身體后翻或者朝一側(cè)倒，做轉(zhuǎn)圈運(yùn)動；鴨流感患鴨頭和顏面部水腫，皮膚發(fā)紺，有的表現(xiàn)神經(jīng)癥狀及下痢；鴨病毒性肝炎患病雛鴨常伏地、縮頸，蹬腳做劃槳動作，病鴨在3～4 d 內(nèi)死亡，死亡時頭后仰，呈角弓反張狀。因此，本研究采集了發(fā)病鴨心臟組織，通過實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢測，成功分離并鑒定致病菌為糞腸球菌，并確認(rèn)該起病例由糞腸球菌感染引起。2008 年江蘇省揚(yáng)州市寶應(yīng)縣曾報(bào)道過一起鴨糞腸球菌感染[13]，但糞腸球菌是否在揚(yáng)州市存在地區(qū)性流行有待進(jìn)一步研究。本病例為糞腸球菌感染鴨并引起發(fā)病提供了新的證據(jù)，確認(rèn)了糞腸球菌感染鴨的事實(shí)。同時也提醒廣大養(yǎng)殖戶在實(shí)際生產(chǎn)過程中，要提高對糞腸球菌感染的重視程度，做好日常飼養(yǎng)管理，預(yù)防糞腸球菌感染的發(fā)生。

下一步，將對江蘇省其他地區(qū)水禽糞腸球菌感染以及其他常發(fā)細(xì)菌病展開調(diào)研并對菌株進(jìn)行耐藥性研究，以摸清流行情況并指導(dǎo)江蘇省養(yǎng)殖戶用藥，確保鴨產(chǎn)業(yè)的高效健康發(fā)展。