一例牛丘疹性口炎的診斷及病原序列分析

任云鑫，湯承，岳華

（西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川成都 610041）

牛丘疹性口炎（bovine papular stomatitis，BPS）是牛的一種高度傳染性疾病，由牛丘疹性口炎病毒（bovine papular stomatitis virus，BPSV）感染引起[1]。BPSV 會(huì)導(dǎo)致患病牛唇部、牙齦、口腔、舌頭、前胃和乳房出現(xiàn)丘疹、結(jié)節(jié)和糜爛，其中鼻唇鏡和鼻孔周圍會(huì)形成明顯突起的火山樣病灶，患病奶牛由于乳房局部疼痛，無法完成擠奶，導(dǎo)致泌乳中斷；偶爾還會(huì)繼發(fā)乳腺炎，導(dǎo)致患畜哺乳期中斷和產(chǎn)奶量下降，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[2]。此外，如果人與被感染動(dòng)物有密切接觸也可感染BPSV，被感染者病變通常出現(xiàn)在手上，一般由丘疹或直徑3～8 mm 的結(jié)節(jié)組成，有些病例還會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱、紅斑性疹、液下腺病和肌痛等癥狀[3]。BPSV 最早于1884 年被發(fā)現(xiàn)，日本、阿根廷、巴西、韓國(guó)、美國(guó)和中國(guó)等多國(guó)都報(bào)道了BPS暴發(fā)[1，4-8]。國(guó)外報(bào)道：自美國(guó)弗吉尼亞州采集的45 份?？谇皇米又杏?1 份檢出BPSV 陽性，陽性率高達(dá)68.89%[9]；日本某牛場(chǎng)14 頭小牛中9 頭被檢測(cè)為BPSV 陽性，陽性率為64.29%[10]。我國(guó)關(guān)于BPS 的流行病學(xué)資料未見報(bào)道，而國(guó)外的流行病學(xué)調(diào)查資料也較為匱乏，因此開展BPS 流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義。除了BPSV，口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV）、牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）和牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒（lumpy skin disease viruses，LSDV）等也可以導(dǎo)致患畜出現(xiàn)流涎或口腔黏膜潰瘍和糜爛的臨床癥狀[11-12]。這幾種病原引起的癥狀相似，因此往往需要實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)進(jìn)行病原鑒定。

BPSV 是一種DNA 病毒，基因組為單一的線性雙鏈DNA，大小約134 kb，含有131 個(gè)推定的基因編碼區(qū)[13]。BPSV 屬于痘病毒科（Poxviridae）副痘病毒屬（Parapoxvirus，PPV）。該屬成員還包括羊傳染性膿皰病毒（Orf virus，ORFV）、偽牛痘病毒（pseudocowpox virus，PCPV）和新西蘭紅鹿副痘病毒（parapoxvirus of red deer in New Zealand，PVNZ）等。PPV 成員的B2L基因具有高度保守性[14]，其包含1 個(gè)1 137 bp 的開放閱讀框，編碼378 個(gè)氨基酸，是PPV 成員分子檢測(cè)最常用的靶基因[15]。目前，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)BPSV 的方法中有普通PCR、半巢式PCR 和qPCR 檢測(cè)方法，其中半巢式PCR 方法最常用并能擴(kuò)增所有PPV 成員的B2L基因序列[8，15-16]。B2L基因引物片段超過500 bp，因此可以進(jìn)一步用于PPV 成員的進(jìn)化分析[17-19]。本研究對(duì)一奶牛場(chǎng)犢牛發(fā)生的口腔黏膜糜爛疾病病原進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室鑒定并分析病原的B2L基因分子特征，以期為國(guó)內(nèi)BPS 防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床樣品和病毒核酸

2021 年12 月四川省某奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生了以口腔黏膜糜爛等為主要特征的疾病。該場(chǎng)96 頭2～3月齡犢牛中，有46 頭患病，發(fā)病率達(dá)47.92%；患畜臨床主要表現(xiàn)為精神沉郁、食欲不振、牙齦紅腫以及鼻唇鏡部有紅色丘疹或潰瘍病灶等（圖1）。無菌采集10 份患病犢牛口腔黏膜糜爛樣本置于-20 ℃?zhèn)溆?。BPSV、FMDV、BVDV 和LSDV 的陽性核酸樣品，由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

圖1 犢牛鼻唇鏡部潰瘍和牙齦紅腫

1.2 主要試劑與儀器

TrizolTMReagent、Prime ScriptTM、2×TaqPCR Master Mix、DNA Marker，購自日本TaKaRa 公司；凝膠成像系統(tǒng)（VersaDoc2000）、PCR 儀（ThermoFisher），購自賽默飛世爾科技；核酸蛋白電泳儀（powerpacuniversalTM），購自美國(guó)Bio-Rad 公司；高速冷凍離心機(jī)（5804），購自德國(guó)Eppendorf 公司。

1.3 樣本處理與核酸提取

所有患病犢牛的口腔黏膜糜爛樣本經(jīng)-80 ℃反復(fù)凍融3 次后按照1:3 體積比加入PBS，充分研磨后5 000 r/min 離心10 min，收集上清并分成兩份。一份采用酚-氯仿法進(jìn)行DNA 提??；另一份按照TrizolTMReagent 說明書進(jìn)行總RNA 提取，并按照Prime ScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。DNA 和cDNA 均放置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病原檢測(cè)

用文獻(xiàn)報(bào)道的特異性PCR 檢測(cè)方法，分別對(duì)FMDV[20]、BVDV[21]和LSDV[22]進(jìn)行檢測(cè)。BPSV檢測(cè)采用半巢式PCR 方法。病原檢測(cè)引物信息見表1，其中PP1 和PP2 分別為第一次擴(kuò)增反應(yīng)的上游和下游引物，PP3 和PP4 分別為第二次擴(kuò)增反應(yīng)的上游和下游引物。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.50%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，陽性產(chǎn)物送上海生工生物有限公司雙向測(cè)序后進(jìn)行BLAST 比對(duì)。

表1 病原檢測(cè)引物信息

1.5 BPSV 序列分析

將病原檢測(cè)中擴(kuò)增的594 bp BPSV PCR 產(chǎn)物純化回收后克隆到pClone007 載體中，并將其轉(zhuǎn)化到EHA105 感受態(tài)細(xì)胞中構(gòu)建重組質(zhì)粒，測(cè)序后利用MEGA 4.0 軟件與GenBank 中BPSV（GenBank登錄號(hào)：JN171861、KF478805、JN171854、JN171860、KF830858）和PCPV 的B2L基因（GenBank 登錄號(hào)：KF830856、KT992225、KF830855）進(jìn)行多重序列比對(duì)，并利用鄰近法（Neighbor-Joining）建立系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 病原檢測(cè)

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果（圖2）顯示：在BPSV 的半巢式PCR 檢測(cè)中，10 份犢?？谇火つっ訝€樣本中有 6 份樣本擴(kuò)增出大小約230 bp 的片段，陽性率為60.00%；PCR 產(chǎn)物雙向測(cè)序后證實(shí)為BPSV，其余3 種病原均未檢出。

圖2 PCR 檢測(cè)結(jié)果

2.2 BPSV B2L 基因序列分析

成功從6 個(gè)BPSV 陽性樣本中克隆出6 條BPSV 的B2L基因片段，分別命名為BPSV/SWUN01、BPSV/SWUN02、BPSV/SWUN03、BPSV/SWUN04、BPSV/SWUN05 和BPSV/SWUN06（GenBank登錄號(hào)：ON469818—ON4698123），長(zhǎng)度均為594 bp，編碼198 個(gè)氨基酸；6 條核苷酸序列之間的同源性為99.30%～100%，氨基酸序列同源性為100%；與GenBank 數(shù)據(jù)庫中所有BPSVB2L基因的核苷酸同源性為97.39%～99.33%，氨基酸同源性為100%。基于核苷酸建立的系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹（圖3）顯示：本研究中擴(kuò)增得到的6 條B2L基因序列位于兩個(gè)不同的分支內(nèi)，其中BPSV/SWUN01、BPSV/SWUN02和BPSV/SWUN03 單獨(dú)聚為一個(gè)大支，而BPSV/SWUN04、BPSV/SWUN05 和BPSV/SWUN06 和孟加拉國(guó)的BSH07005 毒株遺傳距離最近，但3條序列又聚集為獨(dú)立的一個(gè)小分支。對(duì)擴(kuò)增獲得的B2L基因序列進(jìn)行進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，與BPSV/SWUN04、BPSV/SWUN05 和BPSV/SWUN06 相比，單獨(dú)聚為一個(gè)大支的BPSV/SWUN01、BPSV/SWUN02 和BPSV/SWUN03 發(fā)生了4 個(gè)共有的無義突變（C292G、A304G、C415T 和G538C）。

圖3 BPSV 部分B2L 基因片段核苷酸進(jìn)化樹

3 討論

BPSV 是導(dǎo)致犢?？谘椎闹匾≡?，在世界有廣泛的地域分布[2，5，16]。本研究從四川省某奶牛場(chǎng)患病犢牛采集的10 份犢牛口腔黏膜糜爛樣本中檢出6 例BPSV 陽性，其他病原未檢出，結(jié)合發(fā)病犢牛臨床癥狀，可以確診該奶牛場(chǎng)發(fā)生的犢?？谇火つっ訝€病癥是由BPSV 感染所致。國(guó)內(nèi)關(guān)于BPS病例的報(bào)道涉及四川省、青海省、廣西壯族自治區(qū)等多個(gè)地區(qū)，表明BPSV 在我國(guó)分布范圍可能較廣。牦牛和水牛均對(duì)BPSV 易感，但本研究發(fā)現(xiàn)奶牛也可感染BPSV。這可能意味著奶牛、牦牛和水牛等各種?？赡芏紝?duì)BPSV 易感。國(guó)內(nèi)關(guān)于BPS 的流行病學(xué)資料和分子特征研究匱乏，并且在GenBank數(shù)據(jù)庫中未見我國(guó)BPSV 毒株的基因序列資料。本研究將擴(kuò)增的6 條BPSV 部分B2L基因序列上傳于GenBank 數(shù)據(jù)庫內(nèi)，豐富了國(guó)內(nèi)BPSV 毒株的資料?；诤塑账峤⒌倪M(jìn)化樹顯示，擴(kuò)增的6條B2L序列分為兩個(gè)分支，表明感染該場(chǎng)犢牛的BPSV 可能有兩種不同的毒株。已有研究[6]表明，不同BPSV 毒株共感染將引起患畜表現(xiàn)出更嚴(yán)重的臨床癥狀。另一項(xiàng)研究[9]從臨床健康小牛身上采集了45 份口腔拭子進(jìn)行BPSV 檢測(cè)，結(jié)果有31 份樣本檢出陽性，陽性率為68.89%，表明亞臨床感染的牛是BPS 的重要傳染源，因此需要加強(qiáng)臨床健康畜群的BPS 監(jiān)測(cè)。

對(duì)成功獲得的6 條長(zhǎng)594 bp 的BPSVB2L基因序列進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，與擴(kuò)增獲得的另外3 條序列相比，在進(jìn)化樹中單獨(dú)聚為一個(gè)大支的BPSV/SWUN01、BPSV/SWUN02 和BPSV/SWUN03 毒株序列發(fā)生了4 個(gè)共有的無義突變（C292G、A304G、C415T 和G538C）。盡管目前關(guān)于BPSVB2L基因無義突變的生物學(xué)意義尚不清楚，但B2L基因是PPV 成員的檢測(cè)靶基因，因此進(jìn)一步開展BPSV 流行毒株B2L基因核苷酸遺傳多樣性研究，對(duì)國(guó)內(nèi)建立BPSV 的特異性PCR 檢測(cè)方法具有重要意義。