2022 年鄂西地區(qū)PRRSV ORF5 基因遺傳進(jìn)化分析

歐陽艷，劉發(fā)志，王孝忠，李祚丹，熊同舟，杜建豐

（1.湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北宜昌 443000；2.宜昌市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖北宜昌 443000；3.宜昌正大畜牧有限公司，湖北宜昌 443000）

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）是引發(fā)豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）的病原。目前，在全球范圍內(nèi)，除瑞士等少數(shù)國(guó)家沒有暴發(fā)PRRS 疫情外，其他國(guó)家的養(yǎng)豬業(yè)都深受其害[1]。豬感染PRRSV 后表現(xiàn)厭食、發(fā)熱、耳發(fā)紺、流鼻涕等癥狀，母豬感染后在懷孕110 d 左右可發(fā)生流產(chǎn)，產(chǎn)弱胎、死胎或木乃伊胎，產(chǎn)出的弱胎也會(huì)很快死亡[2-4]。

PRRSV 屬于RNA 病毒，其結(jié)構(gòu)蛋白GP5 是重要的保護(hù)性抗原蛋白，具有高度變異性，因此GP5 蛋白編碼基因開放閱讀框ORF5 常被用于遺傳變異分析[5]。為了解鄂西地區(qū)PRRSV 的遺傳變異情況，本研究對(duì)2022年采自該地區(qū)的672份豬血液、肺臟組織等樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測(cè)，并對(duì)部分陽性樣品進(jìn)行ORF5 基因序列遺傳進(jìn)化分析，以期為鄂西地區(qū)PRRS 防控提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 PRRSV 通用型實(shí)時(shí)熒光RTPCR 檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自元亨生物藥業(yè)有限公司；DNA/RNA核酸提取試劑盒，購(gòu)自天隆科技有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 高速組織勻漿機(jī)（TissueLyser LT），德國(guó)凱杰公司產(chǎn)品；渦旋震蕩儀（Mx-S）、賽洛捷克公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)（Centriguge 5417R），德國(guó)艾本德公司產(chǎn)品；Ⅱ級(jí)生物安全柜（AC2-4S1），新加坡藝思高科技有限公司產(chǎn)品；熒光定量 PCR 擴(kuò)增儀（LightCycler 96），德國(guó)羅氏診斷公司產(chǎn)品；生化培養(yǎng)箱（SPX-250B-Z），上海博訊實(shí)驗(yàn)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；醫(yī)用冷藏箱（HYC-940），青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司產(chǎn)品；核酸提取儀（NP968），西安天隆科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病料采集和處理 在鄂西地區(qū)采集疑似PRRS 發(fā)病豬血液、肺臟組織等樣品共672 份，其中伍家崗區(qū)、夷陵區(qū)、興山縣、長(zhǎng)陽自治縣（簡(jiǎn)稱長(zhǎng)治縣）、猇亭區(qū)、五峰自治縣（簡(jiǎn)稱五峰縣）、恩施市7 個(gè)縣（市、區(qū)）的血液、肺組織樣品采自小規(guī)模育肥豬場(chǎng)，枝江市的血液、肺組織樣品采自規(guī)?；N豬場(chǎng)。組織樣品剪碎混勻后，加生理鹽水充分勻漿，高速離心后，取上清液用于RNA 提??；血液樣品采集后先放置在37 ℃生化培養(yǎng)箱中2 h，然后轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱過夜，待血清析出后無菌分裝，用于RNA 提??；抗凝血樣品混勻后直接用于RNA提取。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 使用歐陽艷等[6]設(shè)計(jì)的針對(duì)Nsp2基因的引物和1 對(duì)檢測(cè)并擴(kuò)增完整ORF5 基因序列的引物（表1）進(jìn)行擴(kuò)增。

表1 本研究使用的引物

1.2.3 RNA 提取與實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測(cè) 用DNA/RNA 核酸提取試劑盒提取病毒總RNA，再使用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。PCR 反應(yīng)體系25.0 μL：無菌無核酸酶水5.0 μL、RT-PCR 反應(yīng)液12.5 μL、酶混合液1.0 μL、熒光探針4.5 μL、模板RNA 2.5 μL。PCR 反應(yīng)程序：42 ℃5 min，95 ℃變性10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，40個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)第二步（60 ℃ 35 s）收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)FAM，淬滅基團(tuán)NONE。結(jié)束后根據(jù)樣品Ct 大小及擴(kuò)增曲線形成情況判定結(jié)果[7-8]。

1.2.4 ORF5 基因擴(kuò)增與測(cè)序 將陽性樣品用病毒核酸提取試劑盒提取RNA 后進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，將反應(yīng)產(chǎn)物送擎科生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.5 ORF5 基因遺傳進(jìn)化分析 應(yīng)用DNAstar軟件對(duì)測(cè)序獲取的ORF5 基因序列與參考毒株序列進(jìn)行比對(duì)分析，利用Clustal 2.1 和Mega-7.0 軟件，基于Neighbor-Joining 運(yùn)算法，繪制遺傳進(jìn)化樹[6]。參考毒株的背景信息見表2。

表2 參考毒株信息

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床樣品RT-PCR 檢測(cè)

2022 年，共收集檢測(cè)來自鄂西地區(qū)8 個(gè)縣（市、區(qū)）的血液、肺組織等樣品672 份，使用PRRSV 實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 試劑盒檢測(cè)。結(jié)果（表3、圖1）顯示：33 份樣品為PRRSV 陽性，陽性檢出率為5%；使用歐陽艷等[6]設(shè)計(jì)的針對(duì)Nsp2基因引物進(jìn)行分類，其中高致病性毒株（HP-PRRSV）23 份，占69.7%，分布于伍家崗區(qū)、夷陵區(qū)、興山縣、長(zhǎng)陽縣、猇亭區(qū)等5 個(gè)縣（區(qū)），是鄂西地區(qū)主要流行毒株；類NADC30 毒株（NADC30-like PRRSV）10 份，占30.3%，分布于興山縣、長(zhǎng)陽縣、枝江市、猇亭區(qū)等4 個(gè)縣（市、區(qū)），是次要流行毒株。

圖1 PRRSV Nsp2 基因部分片段擴(kuò)增結(jié)果

表3 2022 年病料檢測(cè)結(jié)果

2.2 ORF5 基因同源性分析

本研究共擴(kuò)增獲得4 份陽性樣品（2022YCLPFA、2022YCLPFA1、2022YCYZD、2022 YCZDBLZ）ORF5基因序列，其中2022YCLPFA、2022YCLPFA1采自長(zhǎng)陽縣，2022YCYZD采自夷陵區(qū)，2022YCZDBLZ 采 自枝江市。與參考毒株序列經(jīng)同源性比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)：4 份陽性樣品間的ORF5 基因序列同源性為81.4%～98.5%，其與HP-PRRSV代表株JXA1同源性為80.3%～95.9%，與NADC30-like PRRSV代表株HENAN-XINX 同源性為80.8%～81.6%，與經(jīng)典PRRSV 代表株VR-2332 同源性為80.3%～84.7%（圖2）。

圖2 ORF5 基因序列之間同源性分析結(jié)果

2.3 ORF5 序列遺傳進(jìn)化樹分析

由圖3可知：2022YCLPFA（長(zhǎng)陽）、2022YCLPFA1（長(zhǎng)陽）、2022YCYZD（夷陵）3份陽性樣品ORF5 序列與JXA1、TJ-M 在同一分支（Lineage 8.7），屬于HP-PRRSV；2022YCZDBLZ（枝江）樣 品 與ZJ1407、JL580、HENAN-XINX、NADC30LIKEXD-HN-004 遺傳關(guān)系較近，在同一分支（Lineage 1.9），屬于類NADC30 毒株。

圖3 PRRSV ORF5 基因進(jìn)化樹

2.4 GP5 蛋白氨基酸序列分析

經(jīng)序列比對(duì)分析，GP5 蛋白氨基酸序列高變區(qū)，在誘騙表位（27～30 aa）出現(xiàn)29G →29C；在中和表位，HP-PRRSV 毒株出現(xiàn)氨基酸替換39A →39T，類NADC30 毒株出現(xiàn)38A →38T（圖4）。

3 討論

本研究共檢測(cè)了來自鄂西地區(qū)8 個(gè)縣（市、區(qū)）的672 份病料樣品，發(fā)現(xiàn)PRRSV 陽性檢出率為5%。其中：HP-PRRSV 陽性樣品占69.7%，來自于伍家崗區(qū)、夷陵區(qū)、興山縣、長(zhǎng)陽縣、猇亭區(qū)等5 個(gè)縣（市、區(qū)），可能是鄂西地區(qū)的主要流行毒株；類NADC30 陽性樣品占30.3%，來自于興山縣、長(zhǎng)陽縣、枝江市、猇亭區(qū)等4 個(gè)縣（市、區(qū)），可能是鄂西地區(qū)的次要流行毒株。從上述結(jié)果可以看出，長(zhǎng)陽縣、興山縣、猇亭區(qū)等地存在2 個(gè)毒株的混合流行，因此各場(chǎng)疫苗接種時(shí)要先進(jìn)行檢測(cè)，一定要選擇與本場(chǎng)流行毒株匹配的疫苗，否則會(huì)導(dǎo)致免疫失敗。

本研究獲得4 份陽性樣品的ORF5 基因序列同源性為81.4%～98.5%，其與HP-PRRSV代表株JXA1同源性為80.3%～95.9%，與NADC30-like PRRSV代表株HENAN-XINX同源性為80.8%～81.6%，與經(jīng)典PRRSV 代表株VR-2332 同源性為80.3%～84.7%，說明鄂西地區(qū)流行毒株的ORF5 基因序列正在發(fā)生一些新的變化。

自1996 年郭寶清等[9]首次分離到PRRSV CH-1a毒株以來，Lineage8.7分支PRRSV 在我國(guó)已流行20 多年。通過遺傳進(jìn)化分析可知，本研究獲得的2022YCLPFA、2022YCLPFA1、2022YCYZD 3 份陽性樣品ORF5 序列與毒株JXA1、TJ-M在同一分支（Lineage 8.7），屬于HP-PRRSV 毒 株；2022YCZDBLZ 與JL580、HENAN-XINX 遺傳關(guān)系較近，在同一分支（Lineage 1.9），屬于NADC30-like PRRSV 毒株。Lineage 1.9 分支PRRSV 自2013 年以來也在我國(guó)廣泛流行，并不斷發(fā)生變異和重組[10]。我國(guó)先后研制了經(jīng)典株滅活疫苗、高致病性毒株減毒活疫苗等商品化疫苗，雖然在控制PRRS 大規(guī)模暴發(fā)方面發(fā)揮了一定作用，但PRRSV 易變異，類NADC30 毒株也開始廣泛流行，因而期待更為安全有效，特別是針對(duì)類NADC30 毒株的疫苗盡早問世。

研究[11]表明，GP5 蛋白上存在的中和抗原位點(diǎn)與免疫保護(hù)有關(guān)。本研究獲得的4 份PRRSV GP5 氨基酸序列與參考毒株比對(duì)，在誘騙表位（27～30 aa）發(fā)現(xiàn)氨基酸替換29G →29C，在中和表位，HP-PRRSV 毒株出現(xiàn)氨基酸替換39A →39T，類NADC30 毒株出現(xiàn)38A →38T。這些變異有可能會(huì)影響機(jī)體中和抗體的產(chǎn)生，但需進(jìn)一步研究。

綜上所述，鄂西地區(qū)存在HP-PRRSV 和NADC30-like PRRSV 兩種毒株的流行，并且其GP5 蛋白氨基酸序列已發(fā)生了多個(gè)變異，有可能會(huì)影響疫苗的免疫保護(hù)效果。建議持續(xù)加強(qiáng)監(jiān)測(cè)，一定要選擇與本場(chǎng)流行毒株匹配的疫苗進(jìn)行免疫。