2021 年廣西柳州市規模肉鴨養殖場高致病性禽流感監測

梁競臻，王翠，覃艷然，周師師，許宗麗，馬小蓉，盧軍，黃小武，李志源，嚴斯剛

（柳州市動物疫病預防控制中心，廣西柳州 545005）

高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza，HPAI）是由正黏病毒科流感病毒屬 A型流感病毒引起的一種烈性禽類傳染病[1]。HPAI是我國規定的一類動物疫病，其暴發不僅給養殖業造成巨大經濟損失，還會對人體健康、公共衛生安全帶來嚴重威脅。HPAI 目前主要由H5 和H7亞型高致病性禽流感病毒（highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV）引起[2]。HPAIV 易感動物種類很多，包括雞、鴨、鵝等家禽，野鴨、天鵝、雁等野禽，以及部分哺乳動物。水禽尤其是鴨、鵝被認為是流感病毒的天然儲存庫和傳染源[3]。而我國是世界上最大的水禽生產國，因此監測我國鴨場中HPAIV 流行情況意義重大。

肉鴨產業是我國傳統特色產業，鴨肉也是居民日常生活中不可或缺的肉類。隨著養鴨行業的集約化、規模化發展，“公司+基地+農戶”模式的規模養殖逐漸成為主流。近年來，新模式下的規模肉鴨養殖業已成為柳州市農業及農村經濟發展的重要支柱產業之一，也是農民增收的重要途徑之一。我國對HPAI 實行H5+H7 三價滅活疫苗強制免疫制度，要求抗體合格率保持在70%以上，但該模式下有關廣西地區規模肉鴨養殖場HPAI 免疫效果和帶毒情況鮮有報道。為加強HPAI 防控，更好地了解柳州市轄區內規模化養殖環境下肉鴨的H5、H7 亞型HPAIV 免疫抗體水平和流行情況，2021年采集轄區范圍內各縣區規模肉鴨養殖場的血清和喉頭/泄殖腔棉拭子樣品進行檢測，以期掌握本地區肉鴨群體中HPAI 免疫情況和病毒流行趨勢，為下一步禽流感防控工作提供依據。

1 材料

1.1 主要試劑

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）H5亞型（H5N1 Re-11/Re-12 株）血凝抑制試驗抗原，購自哈爾濱維科生物技術有限公司；H7亞型（H7N9 Re-3 株）血凝抑制試驗抗原以及標準陰陽性血清，購自哈爾濱國生生物科技股份有限公司；H5、H7亞型AIV 實時熒光RT-PCR 檢測試劑盒，購自哈爾濱元亨生物藥業有限公司；病毒DNA/RNA 提取試劑盒（4.0），購自西安天隆科技有限公司。

1% SPF 雞紅細胞，按照《高致病性禽流感診斷技術》（GB/T 18936—2020）[5]配制。

1.2 主要儀器

10～1 000 μL 單道移液器及25～200 μL 微量移液器，購自德國Eppendorf 公司；96 孔V 型反應板，購自廣西南寧神九生物制品有限責任公司；MicroFill 微孔板分液器，購自德國BioTek 公司；MM-2 型微量振蕩器，購自江蘇金壇市醫療儀器廠；NPA-32P 自動核酸純化儀，購自杭州博日科技有限公司；LightCycler96 熒光PCR 儀，購自瑞士Roche 公司。

1.3 樣品來源

2021 年，柳州市共有規模肉鴨養殖場183 個，總存欄約381.06 萬羽。對全市部分肉鴨規模養殖場（存欄1 000 只以上，重點是快大型肉鴨），在第一季度3 月底前、第二季度5 月底前、第三季度9 月底前和第四季度11 月底前，各進行1 次集中采樣檢測。采用配額抽樣方法[4]，每個縣區按要求選取轄區內不少于25%的肉鴨規模養殖場（不重復抽樣，盡量確保全年全覆蓋，根據每季度區域內養殖情況適時調整數量），每季度采集樣品均為同一批次免疫HPAI 三價疫苗后21 d 的肉鴨樣品。依據國家和自治區動物疫病監測與流行病學調查計劃，每個規模場采集血清樣品不少于30 份，喉頭/泄殖腔棉拭子不少于5 份。樣品采集由各縣區動物疫病預防控制中心實施，詳情見表1。

表1 柳州市各縣區規模肉鴨養殖場養殖情況及樣品采集信息統計

2 方法

2.1 免疫效果監測

2.1.1 免疫抗體檢測 通過血凝抑制試驗（HI）測定H5 亞型（H5N1 Re-11/Re-12 株）和H7 亞型（H7N9 Re-3 株）HA 抗原效價，根據抗原效價配置四單位病毒，通過血凝抑制試驗（HI）檢測肉鴨血清中的免疫抗體滴度。具體操作方法參照《高致病性禽流感診斷技術》（GB/T 18936—2020）[5]。

2.1.2 結果判定 血清樣品HI 效價≥4.00log2，判為陽性；HI 效價＜4.00log2，判為陰性。標準陰性血清對照孔滴度≤2.00log2，標準陽性對照血清抗體效價與已知效價誤差不超過1 個滴度，試驗結果成立。

2.1.3 數據分析 通過WPS Excel 軟件和SPSS 19.0 軟件對檢測數據進行整理、統計和分析。運用卡方檢驗分析H5 和H7 亞型免疫抗體合格率在不同區域和不同季度間的差異，P＞0.05 表示差異不顯著，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2.2 感染情況監測

2.2.1 病原檢測 按病毒DNA/RNA 提取試劑盒說明書提取核酸后，參照檢測試劑盒使用說明書配制H5、H7 亞型實時熒光RT-PCR 反應體系，通過熒光PCR 儀的循環反應，擴增特異片段。

2.2.2 結果判定 陽性對照Ct ≤30 并出現特異性擴增曲線，陰性對照無Ct 值并且無特異性擴增曲線，試驗結果成立。被檢樣品Ct ≤30 并出現特異性擴增曲線，判為陽性；被檢樣品Ct ≥37，判為陰性；被檢樣品30 ＜Ct ＜37 并出現特異性擴增曲線，需重新抽樣提取核酸，擴增后再進行結果判定，如仍是可疑，可判為陽性。

3 結果與分析

3.1 總體情況

2021 年，共檢測151 家肉鴨規模養殖場，采集4 540 份血清樣品進行H5、H7 亞型免疫抗體檢測，檢出H5 亞型免疫抗體合格樣品3 472 份，免疫合格率為76.48%，平均滴度為5.52log2；檢出H7 亞型免疫抗體合格樣品3 087 份，免疫合格率為68.00%，平均滴度為4.20log2。經卡方檢驗，H5 亞型免疫抗體總合格率極顯著高于H7 亞型（P＜0.01）。檢測病原學樣品803 份，結果均為陰性。

3.2 不同縣區情況

不同縣區的抗體檢測結果（表2）顯示：H5、H7 亞型免疫抗體合格率在不同區域間存在一定差異，縣級地區的H5、H7 亞型免疫抗體總合格率均顯著高于城區（P＜0.01）。H5 亞型免疫抗體合格率，E 縣最高（P＜0.01），其次為D 縣和H 區，J 區最低（P＜0.05）；H7 亞型免疫抗體合格率，H 區最高（P＜0.05），其次為E 縣和D 縣，G 區最低（P＜0.05）。各縣區的H5 亞型平均抗體滴度為（3.72～8.50）log2，H7 亞型為（2.58～6.71）log2，均為E 縣最高。抗體合格率和平均滴度未完全呈正相關關系，如某些地區合格率雖然未達70%以上，但其平均滴度大于4.00log2。

表2 柳州市各縣區免疫抗體檢測結果統計

3.3 不同季度情況

3.3.1 抗體合格率 如表3、圖1 所示，各季度不同縣區規模場肉鴨的禽流感免疫抗體水平存在差異。H5 亞型免疫合格率，第二季度最高（P＜0.05），第三季度最低（P＜0.01），其中第一、二、四季度抗體總合格率均達到70.00%以上，而第三季度未達到70.00%；H7 免疫合格率，第四季度最高（P＜0.01），第一季度最低，抗體合格率呈逐漸上升趨勢，其中僅第四季度達到70.00% 以上。綜合分析發現，禽流感抗體合格率依次為第四季度＞第二季度＞第一季度＞第三季度。通過變異系數可看出，抗體合格率越高，離散程度越低。

表3 柳州市各縣區不同季度免疫抗體結果統計

圖1 不同季度免疫抗體合格率分布

3.3.2 平均抗體滴度 如表4～5 所示，不同縣區各季度禽流感平均抗體滴度均呈現不同幅度的波動，其中H5 亞型平均滴度為（2.56～9.62）log2，H7 亞型為（1.97～9.17）log2。H5 亞型平均滴度第二季度最高，第三季度最低，H7 亞型第四季度最高。H5、H7 亞型抗體最高平均滴度均來自E 縣，D縣各季度的平均抗體滴度均大于4.00log2。各縣區不同季度的合格抗體滴度多數處于（4.00～7.00）log2。

表4 不同季度平均免疫抗體滴度統計 單位：log2

4 討論

目前，疫苗免疫是預防禽流感的經濟、有效途徑，而抗體檢測是評價疫苗免疫效果的主要方法，也是免疫水平監測的重點。禽流感病毒變異快，因此及時掌握HPAIV 的變化情況至關重要[6]。此次監測將抗體檢測與病原學檢測有機結合，旨在進一步確保監測的整體準確性[7]。

表5 免疫合格抗體平均滴度比例分布 單位：%

從總體檢測情況來看，H5 亞型免疫抗體總合格率達到70.00%以上，H7 亞型免疫抗體總合格率略低于70.00%，說明本地區肉鴨群體的禽流感整體免疫效果良好，但仍有很大的提升空間。本次監測發現，H5 亞型免疫抗體總合格率極顯著高于H7亞型，這與張輝等[8]、牟愛生等[9]的研究結果相符，說明H5 亞型疫苗免疫原性更佳，也可能與水禽自身機體相關[10]。本地區規模肉鴨養殖場中未檢測出H5、H7 亞型禽流感病毒，說明HPAIV（H5+H7）三價滅活疫苗強制免疫政策有效防控了H5、H7 亞型禽流感病毒的侵襲，免疫屏障得到了有效建立，從而增強了動物抵御疫病的能力。因此，在實際生產中應不斷加強肉鴨群體的禽流感免疫監測，進一步提高其免疫抗體水平，強化免疫屏障。

從不同區域來看，各縣區肉鴨規模場的免疫抗體水平差異較大，存在免疫效果不平衡現象，個別縣區抗體水平離散程度偏大，且群體免疫合格情況存在不穩定性。這一方面可能與養殖場的養殖模式、人員操作以及免疫時間、次數和方法等有關，另一方面可能與不同廠家的重組H5+H7 三價疫苗的抗原含量、生產工藝、免疫佐劑以及保存運輸等方面有關，從而造成免疫后抗體水平存在偏差[11-12]。本次監測發現，各縣的禽流感總體免疫水平優于各區，其中E 縣、D 縣的禽流感抗體免疫水平較好，H5、H7 亞型抗體總合格率均達70.00%以上，尤其是E 縣，除第二季度外，H5、H7 亞型抗體合格率均達100%。楊彩娟等[13]對2014—2018 年廣東省禽流感疫苗強制免疫效果調查發現，水禽在二次免疫后抗體合格率有明顯上升，免疫效果維持在較高水平。本研究對象為快大型肉鴨，生長周期短，大多數養殖場只進行1 次免疫，而E 縣、D 縣的規模場肉鴨使用的是2 次免疫程序，這可能是其免疫效果較好的原因之一。因此，在現有養殖環境下，養殖場應根據實際情況適當調整免疫程序和增加免疫次數。

從不同季度情況來看，各季度不同縣區的規模場肉鴨免疫抗體水平存在差異，其中第一、二季度全市規模肉鴨場的H5、H7 亞型免疫抗體水平相差較大。經調查，這可能與免疫程序有關。謝向萌等[14]研究表明，一免后21 d 的H5 和H7 亞型抗體合格率分別為93%、53%，有一定的差異，而二免后兩者抗體水平一致。肉鴨生長期較短，因此大多養殖場只進行1 次免疫。針對這種現象，各縣區后期對肉鴨免疫程序做出了相應調整，致使到第三、四季度H5、H7 亞型免疫抗體水平相對一致。對各季度進行研究分析可知，H5 亞型抗體合格率最低為39.05%，H7 亞型最低為13.33%，無縣區出現0 滴度現象，說明柳州市肉鴨養殖場的抗體合格率雖然與農業農村部規定的標準（不低于70.00%）還有較大差距，但禽流感疫苗免疫工作未曾中斷，不少肉鴨體內已存在抗體，形成一定的保護力；但是，只有E 縣和D 縣的H5、H7 亞型抗體合格率全年大部分時間維持在70.00%以上，其他縣區均存在2 個季度以上不達標現象，甚至個別縣區全年合格率均小于70.00%；還有一些雖然平均抗體滴度大于4.00log2，但抗體合格率卻低于規定的70.00%，說明還存在漏免、漏補現象，這為禽流感防控埋下了一定隱患。各縣區每季度的禽流感平均抗體效價均呈現不同幅度的波動，僅D 縣每季度的平均抗體滴度均大于4.00log2。研究[15]表明，抗體水平較高的禽群在受到野毒感染時，如果抗體水平在8.00log2 及以上，則健康狀態相對穩定、安全，無死亡，且影響較小。本次監測中，合格抗體滴度多數處于（4.00～7.00）log2，占合格比例的75.36%，說明疫苗免疫對肉鴨起到了不同效力的保護作用，但要達到高效的保護力還需繼續加強免疫。整體分析發現，不同季度的禽流感抗體合格率依次為第四季度＞第二季度＞第一季度＞第三季度。冬春季節是禽流感高發期[6]，但炎熱干燥的夏季同樣值得注意。劉麗貞等[16]進行不同月份水禽H5亞型免疫抗體監測發現，7—10 月各項免疫數據全面下降。這一方面是大多數養殖戶認為天氣炎熱的情況下不會發生禽流感而減少免疫次數，另一方面與熱天氣下的環境應激導致免疫力降低有關。因此，在此期間更要加強警惕。本次監測發現，H5、H7亞型免疫抗體總合格率在第四季度均達到75%以上，這為禽流感防控工作打下了堅實基礎。因此，有必要定期進行禽流感抗體水平檢測，根據實際情況不斷合理改進免疫程序和更新疫苗，對于免疫不到位現象，應立即開展免疫或補免，及時建立保護屏障，增強肉鴨抵御禽流感病毒感染的能力，有效避免禽流感發生。

受養殖模式、采樣條件、人手不足等條件限制，本研究采用的是配額抽樣方法。該方法雖然易于實施，但每個場點抽樣檢測的數量不多，存在主觀性強，場點數和抽樣數量有偏差等問題，與實際情況可能存在一定差異，但整體上能反映柳州市規模肉鴨養殖場的HPAI 免疫抗體水平及病毒流行情況，可為本地進一步開展HPAI 防控工作提供參考。

5 結論

本次監測發現：柳州市規模肉鴨養殖場H5、H7 亞型HPAI 免疫效果整體良好，尤其是H5 亞型免疫效果更好，也未檢測到H5、H7 亞型病原，說明柳州市肉鴨養殖場發生HPAI 的風險較低；但部分城區免疫效果較差，第三季度免疫抗體水平偏低，因此還需繼續加強禽流感免疫監測，做好補免和加強免疫工作。