牛羊芽囊原蟲病研究進展

周天政，居融程，黃尚選，覃建基，肖華春，李軍成，李鳳梅，彭健波

(1. 廣西農業職業技術大學，廣西 南寧 530007；2. 田陽尚選畜牧養殖有限責任公司，廣西 百色 542899)

芽囊原蟲(Blastocystis)是一種厭氧單核細胞寄生蟲，曾長期被認為是一種無害的酵母，但越來越多的研究表明芽囊原蟲廣泛存在于牛羊腸道內，對牛羊健康造成威脅，同時攜帶可感染人類的亞型基因，具有一定的公共衛生風險。本文通過對國內外牛羊感染芽囊原蟲的相關研究報道進行分析，從牛羊感染芽囊原蟲的病原學、基因型、流行病學、致病性、診斷與防治等方面進行綜述，以期為其他動物甚至人類的芽囊原蟲病的預防和控制提供參考。

1 病原學

芽囊原蟲的生物學分類幾經波折，曾先后被認為是酵母菌、真菌、鞭毛蟲等。1912年首先由Brumpt進行分離，并命名為腸道酵母菌[1]。1967年，Zierdt根據形態學、生理學特點，發現其符合原生生物的特征[2]；1988年，Zierdt發現該生物有一個或多個核、光滑粗糙的內質網、高爾基復合體和線粒體樣細胞器；但它不能在真菌培養基上生長，也不能被抗真菌藥物殺死，因此排除真菌的假設[3]。1996年，Silberman等通過與真核生物譜系的部分同源編碼區進行測序對比，建議將其歸為不等鞭毛門、芽囊原蟲綱、芽囊原蟲目、芽囊原蟲科、芽囊原蟲屬[4]。1998年，Cavalier-Smith通過分子系統學研究發現，芽囊原蟲與鞭毛蟲原單胞菌有系統發育關系，兩者存在某些共同的生命周期特征，作為脊椎動物的腸道內共生體似乎可以在宿主之間傳播。但與原單胞菌不同的是，囊蟲沒有鞭毛，因此Cavalier-Smith建議把它歸于一個新創建的類囊蟲亞門[5]。近年來隨著分子生物學、酶系統等技術發展，蟲體新的特征被發現，使其分類學逐步確定下來。

芽囊原蟲體積小，但形態結構多樣化，表現出包括空泡、顆粒、阿米巴、包囊等形態，不同類型形態大小有所差異(圖1)?？张菪统是蛐?，其特征是一個大的空泡，空泡可占細胞體積的90%，在大小上變化很大，直徑為2～200 μm，平均直徑為4～15 μm。顆粒型被認為是由空泡型和其他因素引起的。這些因素包括培養基種類，培養基中的血清濃度以及某些抗菌劑，如抗原蟲藥硝基咪唑類藥物可抑制芽囊原蟲生長從而影響其形態，而其他驅蟲藥、抗真菌和抗菌藥物氨芐青霉素、鏈霉素和慶大霉素等不會對芽囊原蟲的形態產生影響。顆粒型與空泡型有許多相似之處，除了顆粒型在周圍胞質或中央液泡內存在著大量的顆粒，這些顆粒由形態差異的包涵體、結晶和脂滴顆粒等組成。阿米巴型相對較小(直徑為2.6～7.8 μm)，并具有延伸的偽足，曾被認為是空泡型和包囊型之間的中間體。包囊型體積小(直徑為3～5 μm)，呈球形到卵形，并由多層囊壁保護，具有較強的抵抗性，能耐受胃液，可在自然外界環境中存活，被認為是芽囊原蟲在體外傳播的主要類型。在常規糞便檢查或體外培養中常見空泡型，其次是顆粒型。

圖1 芽囊原蟲模式圖

芽囊原蟲具有二元分裂生殖、出芽生殖、裂殖生殖等多種繁殖方式，其中二元分裂生殖最為常見[6]。已有學者根據其不同類型的分化特點對它的生命周期進行了探索[7]。體外試驗結果表明，芽囊原蟲包囊型在培養基中24 h內可發展成空泡型或顆粒型：在1 h時，包囊壁明顯增厚；在3 h時，包囊內出現有多個小液泡，其中包含許多內容物，聚集在細胞質中；在6 h左右時，包囊壁被一層厚厚的包膜取代；在9 h時，胞體由最初的5 μm擴大到7～9 μm，同時包囊內的多個小空泡在細胞中央區域聚集，最終合并形成中央空泡，這樣空泡內包涵體沉積到中央液泡中，形成顆粒型；在12 h時，蟲體仍被包囊壁包圍，但在內部可觀察到二元分裂形成的多個子細胞，以及明顯的空泡和顆粒狀；在24 h時，細胞表面及包囊壁脫落，完成細胞分化[8]。一般認為臨床上芽囊原蟲以經口或糞—口傳播為主，牛羊等動物經口攝入包囊型蟲體后，蟲體在大腸中被激活，并發展成空泡型，最終沉積在糞便排出，但詳細過程仍需要動物試驗進一步證實。

2 基因型

芽囊原蟲遺傳基因具有多樣性，主要表現為其小亞基核糖體RNA基因(Small subunit rRNA gene,SSU rRNA)的核苷酸多態性，2013年報道了17個經典亞型(ST1～ST17)，隨后新的亞型不斷被發現，目前文獻中已有ST32的相關報道。不同的基因亞型表現出不同的宿主特異性、地區差異性。宿主特異性方面，人芽囊原蟲相關研究較多，目前已確認能感染人的基因亞型主要有10種，分別為ST1～ST9和ST12，我國人群芽囊原蟲基因亞型以ST1～ST3為主，各省市的感染率中以貴州(5.69%)、廣西(4.52%)較高[9]。而牛羊等反芻動物感染芽囊原蟲的基因亞型主要有ST1、ST3、ST4、ST5、ST6、ST10、ST14共7種，在我國云南[10-11]、河南[9，12]、陜西[9，13]、青海[9]、吉林[9]等地的牛羊檢出人獸共患的基因型有ST1、ST3、ST4和ST5，表明牛羊等反芻動物可攜帶危害人類的基因型，需要警惕公共衛生風險。在地區差異性方面，中國、英國、意大利、伊朗、馬來西亞等國家和地區牛羊感染芽囊原蟲主要基因型有ST10、ST14，其中優勢基因亞型均為ST10，但也有個別地區或國家有所不同，如美國優勢基因亞型為ST5，而哥倫比亞優勢基因亞型為ST1。我國不同省份檢出的基因型也有會有差異，如云南牛中檢出ST1、ST5、ST10、ST14這4種基因型[9]，而河南奶牛則可檢出ST1、ST2、ST4、ST5、ST10、ST14這6種基因型[12]。不同年齡階段的易感亞型不同，梁霞霞等[10]發現成年牛ST10的感染率(80.32%)高于犢牛(74.47%)。而王莎莎[13]研究發現，秦川牛和奶牛感染芽囊原蟲主要分布于斷奶前犢牛。

3 流行病學

牛羊芽囊原蟲在美國、英國、意大利、印度尼西亞等多個國家以及我國的陜西、河南、云南、廣東等地均有報道。從世界范圍來看，經濟發達、衛生狀況較為良好的地區呈現較低的感染率，相反的則有較高的感染率，如意大利為17.82%[14]，印度尼西亞為100%[15]。這些差異性可能與“糞—口”傳播方式有關，糞便排放及管理不良可成為重要的感染來源。從我國不同區域來看，發病率呈現南北方低而西北西南地區高的趨勢。東北地區(黑龍江)芽囊原蟲感染率為10%左右[16-17]；而西北地區(青海、陜西)則為25%左右[13,18]；西南地區(云南)為27.62%[10]；中原地區(河南)為19.2%[12]；南方地區(廣東)為1.88%[19]。

在其他影響因素中，發育階段、性別、季節是主要因素。發育階段方面，牛芽囊原蟲的感染率隨著年齡的增長呈現先增長再降低的趨勢[19]。犢牛斷奶后感染率(38.6%)明顯高于斷奶前的感染率(13.0%)[13]，而犢牛的感染率(47.00%)顯著高于成年牛(20.96%)[20]；從具體月齡來看，Zhu等[16]發現3～12月齡(36.1%)牛的感染率明顯高于3月齡以內牛(18.8%)；Lee等[21]也發現3～12月齡牛的感染率(20.8%)顯著高于成年牛(7.2%)及3月齡以下的犢牛(4.0%)。斷奶應激造成的免疫力低下可能是牛芽囊原蟲感染率升高的重要因素。而羊芽囊原蟲的感染率也有類似的變化趨勢。黑山羊以1～2歲的感染率最高(50.9%)，1歲以下及2歲以上黑山羊的感染率均呈下降趨勢[11]。而奶山羊、絨山羊則在7～11 月齡時感染率達到最高(66.5%)[22]。性別方面，牛羊芽囊原蟲病中雄性比雌性更易感。梁霞霞等[10]調查發現，云南省云嶺牛雄性的感染率(37.66%)顯著高于雌性的感染率(25.16%)。而謝世臣[11]研究發現，山羊也有相同的趨勢，雄性感染率(45.0%)顯著高于雌性(32.9%)；上述研究結果提示芽囊原蟲的感染可能受到激素的影響，但不同性別在各年齡階段中的差異性仍需要研究證實。季節方面，夏季芽囊原蟲的檢出率高于其他季節[17，18，23]，高溫高濕季節可能適合芽囊原蟲的生長繁殖；但莊爾俊等[24]發現，云南獨龍牛在冬季的感染率最高，提示芽囊原蟲流行病學受多種因素的影響，需要更多臨床試驗進行證實。芽囊原蟲的感染還可能與動物品種、糞便形態及腸道pH等因素有關。

4 致病性

目前，芽囊原蟲的致病性仍存在一定的爭議，可能與感染的基因型、動物種類等相關。芽囊原蟲的致病性在人體得到體現，流行病學調查顯示，免疫功能低下的人更容易被芽囊原蟲感染。而芽囊原蟲的阿米巴型因能排泄蛋白酶，被認為最具危害性，其主要在有癥狀患者的糞便標本中被發現[25]。體外及動物模型研究表明芽囊原蟲因蛋白酶、水解酶等活性，具有潛在的致病性。其中半胱氨酸蛋白酶作為毒力因子可引起細胞骨架的變化促進細胞凋亡，造成腸道通透性增加；誘導黏膜細胞產生白細胞介素-8，造成患者及動物液體流失和腸道炎癥；半胱氨酸蛋白酶還可裂解IgA，從而影響免疫系統[25]。另外質譜分析鑒定了芽囊原蟲分泌產物中的20種半胱氨酸蛋白酶、1種絲氨酸蛋白酶和1種天冬氨酸蛋白酶，這些蛋白酶在破壞腸道功能中有重要作用[26]。水解酶能破壞宿主組織，影響宿主腸道微生物群，使人出現腹瀉、腹痛和嘔吐等胃腸道反應、蕁麻疹等皮膚癥狀[27]。在大鼠等動物建立的芽囊原蟲感染模型也發現回腸和盲腸部位有充血、水腫、細胞黏膜脫落及炎癥細胞浸潤固有層等病理變化[21]。隨著研究的深入，發現芽囊原蟲的致病性存在種屬差異性，基因型上也會有差別。如ST4和ST7亞型的半胱氨酸蛋白酶活性存在顯著差異，與ST4亞型相比，ST7亞型更能誘導腸道上皮通透性增加[28]。但目前沒有牛羊感染芽囊原蟲病后相關癥狀或病變的報道，因此牛羊芽囊原蟲病的影響更多體現在公共衛生方面，澳大利亞的研究顯示ST5亞型在養殖場工人中普遍存在[29]，提醒牛羊飼養人員面臨較高的感染風險。

5 診斷與防治

牛羊芽囊原蟲病的診斷方式一般有臨床診斷和實驗室診斷2種。芽囊原蟲寄生于人體的回盲部，平時并無明顯癥狀，但當人體免疫功能低下時蟲體大量繁殖，可出現腹痛、腹瀉、胃腸脹氣等消化道癥狀；而目前牛羊感染癥狀的報道很少，因此難以從臨床癥狀進行診斷，其診斷方式以實驗室診斷為主，主要有顯微鏡檢查、實驗室培養、血清學檢查、分子生物學等。(1)顯微鏡檢查法，該方法操作簡單，但因芽囊原蟲形態較小且具有多樣性，加上糞便樣品中常含有大量脂質內含物和糖原沉積，造成芽囊原蟲在顯微鏡觀察中容易與脂質體等其他物質混淆，影響病原鑒定，該方法目前在臨床中應用少。(2)實驗室培養法，通過培養菌株而確診，但其對培養條件有嚴格要求且培養時間較長，檢測效率并不高。(3)血清學檢查法，該方法具有較高特異性，但因芽囊原蟲引起免疫應答的抗體效價不高，且不能區分感染的亞型，這也限制該方法的應用。(4)分子生物學法，該方法是當前診斷芽囊原蟲的主要方法，主要有PCR、環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)等。其中基于 SSU rRNA基因檢測和分析的PCR 檢測是一種快捷、高效和敏感的檢測方法，目前已廣泛應用于芽囊原蟲的檢測。SSU rRNA 基因序列可以作為芽囊原蟲不同亞型基因序列的標記，有利于對芽囊原蟲亞型進行統一命名。而LAMP是Notomi等[30]在2000年建立的，具有對實驗設施要求不高、檢測靈敏度和特異性高等優勢，更適合在偏遠地區使用。我國王品雪等[31]優化LAMP的反應體系和反應條件，用于檢測牦牛芽囊原蟲，發現LAMP有較高特異性，且敏感性和重復性優于PCR。

診斷技術的發展為疾病開展針對性預防和治療打下基礎，鑒于芽囊原蟲的糞—口傳播方式，做好牛羊糞便管理和環境衛生工作將是預防芽囊原蟲病的重要方式。平時飼養管理中應及時處理欄舍的糞便，通過堆積發酵等措施殺滅蟲體，同時保持欄舍干燥通風，創造不利于蟲體存活的環境，定期進行欄舍及周邊環境消毒，殺滅其中的蟲體。牛羊感染芽囊原蟲后能提供治療的藥物不多，甲硝唑是治療人芽囊原蟲的首選藥物，但該藥已禁用于食品動物。一些化學藥品如復方新諾明、巴龍霉素等及中藥提取物如石榴根皮(100 μg/mL)[32]、青蒿乙醇提取物(2 000 μg/mL)[33]體外均可抑殺芽囊原蟲，在治療牛羊芽囊原蟲病時可供參考。

6 展望

牛羊芽囊原蟲的感染情況在世界多個國家均有研究報道，表明它是感染牛羊的重要寄生蟲之一。牛羊芽囊原蟲感染呈現出地區、年齡、性別、品種等方面的差異性，以及牛羊所攜帶的ST1、ST3基因亞型與我國人群常見的感染亞型重疊，提示需要防范芽囊原蟲可能造成的公共衛生安全風險。截至目前為止，有關牛羊芽囊原蟲的生活史、致病性、臨床表現等方面，特別是牛羊的優勢基因亞型ST10的致病特點需要深入開展研究，為后續牛羊芽囊原蟲病的防控提供理論依據。