馬立克氏病病毒RLORF1編碼蛋白通過抑制宿主IFN-β表達促進病毒復制

江 波，蔡云虹，曹夢瑤,2，劉文曉，程 晶，許 健,3，李永清

(1. 北京市農林科學院畜牧獸醫研究所，北京 海淀 100097；2. 北京農學院動物科學技術學院，北京 昌平 102206；3. 中國農業科學院蘭州獸醫研究所，甘肅 蘭州 730046)

馬立克氏病病毒(Marek's disease virus，MDV)屬于α皰疹病毒亞科，是雞馬立克氏病的病原，是一種雞高度易感的細胞結合型病毒，雞感染后表現為臟器的多發性腫瘤、神經麻痹以及免疫系統損傷，常誘發其他病原體的合并感染[1]。目前，弱毒疫苗很大程度上控制了雞馬立克氏病的大規模暴發，但不能清除雞群中潛伏的致病性MDV，也無法阻止在免疫壓力下田間MDV的毒力增強[2]。

病毒感染宿主細胞后，宿主細胞通過模式識別受體識別病原相關分子模式后，通過調節干擾素調節因子(Interferon regulatory factor，IRF)、核轉錄激活蛋白1(Nuclear transcription factor activator protein-1，AP-1)和核因子NF-κB等激活I型干擾素(Type I interferon,IFN-I)的表達，進而發揮抗病毒免疫作用[3]。MDV感染后，宿主通過模式識別受體介導IFN-I產生來抵抗病毒感染的同時，MDV也可以通過Meq、pp38、RLORF4等基因抑制宿主細胞IFN-I信號通路的激活，實現其在宿主體內的復制[4-5]。α皰疹病毒的早期轉錄因子在病毒感染過程中可抑制宿主IFN-I信號通路激活，是α皰疹病毒抵抗宿主天然免疫反應實現感染的新途徑[6-7]。感染細胞蛋白0(Infected cell protein 0，ICP0)作為α皰疹病毒的早期轉錄因子編碼蛋白，可以通過多種途徑抑制宿主細胞IFN-I抗感染免疫作用。單純皰疹病毒I型(Herpes simplex virus type 1，HSV-1)可通過ICP0抑制人上皮成纖維細胞DNA中受體干擾素誘導蛋白16(Interferon gamma inducible protein 16，IFI16)活性，進而阻斷干擾素調節因子3(IFN regulatory factor 3，IRF3)的活化，抑制干擾素-β(Interferon-β，IFN-β)的表達與分泌，增強病毒在宿主細胞內的復制[8]。牛皰疹病毒I型(Bovine herpes virus 1，BoHV-1)的ICP0通過直接降解宿主IRF3抑制IFN-β抗感染免疫反應[9]。偽狂犬病毒(Pseudorabies，PRV)的ICP0與P65蛋白互作后限制P65磷酸化，進而抑制NF-κB信號通路的活化[10]。水痘帶狀皰疹病毒(Varicella-zoste virus，VZV)的ORF61編碼蛋白利用其E3泛素連接酶活性阻斷NF-κB亞基入核，抑制IFN-β的抗感染作用[11]。

MDV基因組中不具備典型的ICP0編碼基因，但其RLORF1基因與α皰疹病毒的ICP0編碼基因部分同源[12-13]，提示了RLORF1可能在MDV感染過程中也發揮抑制天然免疫的作用。本試驗利用細菌人工染色體技術制備了缺失RLORF1基因的重組MDV(CVI988△RLORF1和RB1B△RLORF1)，利用基因缺失毒和真核過表達質粒，檢測RLORF1基因對MDV復制和宿主IFN-β應答的影響，進而研究RLORF1編碼蛋白在MDV抑制I型干擾素信號通路過程中的作用方式，以期為探明MDV致病機制提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 細胞、病毒和質粒 雞胚成纖維細胞(Chicken embryo fibroblast，CEF)：按常規方法取9～11日齡SPF雞胚制備單層CEF[14]；DF-1細胞、馬立克氏病病毒MDV疫苗株CVI988/Risepens株、雞MDV疫苗株CVI988株及超強毒株RB1B株的細菌人工染色體(Bacteria artificial chromosome，BAC)系統及其拯救毒株、含有半乳糖激酶Galk基因(GenBank 登錄號：945358)的質粒pSK-Galk，均由本實驗室保存。表達雞MDVRLORF1基因的真核表達質粒pEGF-N1-RLORF1，由本實驗室采用pEGF-N1(英濰捷基上海貿易有限公司)真核表達載體構建并保存。

1.2 主要試劑 DL2 000 DNA Marker，購自大連TaKaRa生物工程公司；質粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠純化試劑盒，均購自天根生化科技有限公司；DMEM、MEM和轉染用營養液opti-MEM，均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；脂質體LipofectamineTM3000，購自英濰捷基上海貿易有限公司；Poly(I∶C)、環鳥苷單磷酸腺苷(Cyclic GMP-AMPs，cGAMPs)，均購自Selleck公司；Maxiprep質粒提取試劑盒，購自QIAGEN公司。

1.3 實驗動物 SFP級雞胚，購自北京勃林格殷格翰維通生物技術有限公司。

1.4RLORF1基因缺失MDV的構建 設計同源重組引物RLORF1-G-FP和RLORF1-G-RP，以pSK-Galk載體為模板，通過PCR擴增攜帶MDVRLORF1基因同源臂的Galk基因片段。PCR程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，32個循環；72 ℃ 5 min。將獲得攜帶MDVRLORF1基因同源臂的Galk基因片段電轉化至含有MDV BAC的EL250大腸桿菌感受態中(電轉化條件：1 850 V，25 μF，100 Ω，1 mm)，置于32 ℃培養箱中培養3～5 d，挑取單克隆用Galk鑒定引物Galk PF和Galk PR進行PCR鑒定。PCR程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，32個循環；72 ℃ 5 min。利用Galk平板將鑒定陽性的細菌單克隆劃線純化1次，提取質粒后使用MDVRLORF1基因特異性引物RLORF1 PF和RLORF1 PR進行PCR鑒定。PCR程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，32個循環；72 ℃ 5 min。選定Galk基因鑒定為陽性，同時RLORF1基因鑒定為陰性的重組EL250菌，提取MDV BAC質粒。將重組MDV BAC DNA轉染含CEF的6孔板中(1 μg/孔，參照LipofectamineTM3000說明書)以用來拯救重組MDV。轉染的細胞置于37 ℃ CO2培養箱培養5 d后，將轉染的CEF進行100倍稀釋后重新接種到新制備的CEF中繼續培養5 d，可以觀察到典型的MDV細胞病變效應，即為制備的RLORF1基因缺失MDV，擴增后置液氮中保存，用于研究RLORF1基因在MDV復制和激活IFN-β反應過程中的作用。本試驗中所用引物信息見表1。

表1 PCR引物信息

1.5RLORF1基因缺失對MDV復制的影響 為研究RLORF1基因缺失對MDV復制的影響，將MDV(CVI988、CVI988ΔRLORF1、RB1B、RB1BΔRLORF1)接種CEF(6孔板，200 PFU/孔)，置37 ℃ CO2細胞培養箱內培養，分別在24、48、72、96 h和120 h收取細胞，提取細胞總DNA，稀釋至50 ng/μL。采用SYBR Green熒光定量PCR方法，以 MDVMeq基因為靶基因設計引物(Meq PF:5′-CCCAACAGCCCCTCCAAACAC-3′，Meq PR:5′-CTTCATGGAGTTTGTCTACA-3′)，10倍倍比稀釋CVI988 BAC和RB1B BAC質粒并建立標準曲線，檢測MDV的絕對含量。PCR程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，58.6 ℃ 1 min，40個循環。

1.6RLORF1基因過表達對MDV復制的影響 將表達RLORF1基因的pEGF-N1-RLORF1真核表達載體轉染CEF(6孔板，2.5 μg/孔)，以pEGF-N1空載體為對照，培養24 h后，將MDV(CVI988、RB1B)分別以相同劑量接種轉染了真核表達質粒的CEF(6孔板，200 PFU/孔)，在感染后的24、48、72、96 h和120 h收取細胞，提取總DNA檢測病毒復制水平，方法同1.5。

1.7RLORF1基因對MDV誘導宿主產生IFN-β的影響 以野生型MDV(CVI988和RB1B)為對照，將MDV病毒(CVI988、CVI988ΔRLORF1、RB1B、RB1BΔRLORF1)接種CEF(6孔板，200 PFU/孔)，置37 ℃ CO2細胞培養箱內培養，分別在24、48、72、96 h和120 h收取細胞，提取細胞總RNA并反轉錄成cDNA，以雞GAPDH為內參，采用SYBR Green熒光定量PCR方法檢測IFN-β的轉錄情況。PCR程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s,58.6 ℃ 1 min,40個循環。

1.8RLORF1基因對DF-1細胞表達IFN-β的影響 將表達RLORF1基因的pEGF-N1-RLORF1真核表達載體按照每孔0.25、0.50 μg和1.00 μg轉染12孔細胞板中的DF-1細胞，以1.00 μg pEGF-N1空載體為對照按照操作說明書進行轉染，培養24 h后分別用免疫刺激劑Poly(I ∶C)、cGAMPs處理細胞(1 μg/孔)，12 h后收取細胞，提取RNA反轉錄后檢測IFN-β的轉錄情況，方法同1.7。

2 結果

2.1RLORF1基因缺失MDV的構建 利用細菌人工染色體技術拯救后分別利用MDVRLORF1特異性引物和Galk特異性引物對RLORF1基因缺失的重組MDV(CVI988ΔRLORF1和RB1BΔRLORF1)進行檢測后發現，CVI988ΔRLORF1和RB1BΔRLORF1均無法擴增出RLORF1基因(717 bp，GenBank登錄號：ADA83408.1)，野生型MDV(CVI988和RB1B)能夠擴增出RLORF1基因(圖1A)，CVI988ΔRLORF1和RB1BΔRLORF1能夠擴增出標記基因Galk(1 381 bp)，而野生型CVI988和RB1B不能夠擴增出Galk基因片段(圖1B)，表明CVI988ΔRLORF1和RB1BΔRLORF1病毒基因組DNA構建成功。重組病毒轉染CEF后，均產生典型的MDV空斑，且重組病毒在形態上與野生型MDV具有相似的致細胞堆積的特點(圖2)，表明重組RLORF1基因缺失MDV拯救成功。但CVI988ΔRLORF1和RB1BΔRLORF1在CEF中復制時形成的MDV空斑面積明顯小于野生型MDV(圖2)。

圖1 RLORF1基因缺失的重組MDV的PCR鑒定

圖2 RLORF1基因缺失的重組MDV的細胞病變

2.2RLORF1基因缺失抑制MDV的復制 CVI988ΔRLORF1重組病毒復制水平在24～120 h內均顯著低于野生型CVI988病毒(P<0.001)(圖3A)，同時RB1BΔRLORF1重組病毒復制水平在48～120 h內均顯著低于其母本病毒RB1B(P<0.001)(圖3B)。結果表明，缺失RLORF1基因后MDV仍然可以進行增殖，但缺失RLORF1基因可抑制MDV在細胞內的復制。

圖3 RLORF1基因缺失對MDV復制的影響

2.3RLORF1過表達增強MDV的復制 表達MDVRLORF1編碼蛋白的真核表達載體pEGF-N1-RLORF1可以在感染后的48～120 h顯著增強MDV CVI988的復制(P<0.001) (圖4A)，表達MDVRLORF1編碼蛋白的真核表達載體pEGF-N1-RLORF1可以在感染后的24～120 h顯著增強MDV RB1B的復制水平(P<0.001)(圖4B)。結果表明，RLORF1編碼蛋白可以增強MDV的復制。

圖4 RLORF1編碼蛋白對MDV復制的影響

2.4RLORF1基因缺失MDV刺激宿主表達IFN-β的能力增強 在感染后的72～120 h內CVI988ΔRLORF1誘導宿主細胞產生IFN-β的轉錄水平顯著高于野生型MDV CVI988(P<0.05或P<0.001)(圖5A)，在感染后的72～120 h內RB1BΔRLORF1誘導宿主細胞產生IFN-β的轉錄水平也明顯高于野生型MDV RB1B(P<0.05或P<0.001)(圖5B)。結果表明，缺失RLORF1基因的MDV誘導宿主產生IFN-β的能力比野生型MDV強，RLORF1編碼蛋白可能是MDV抑制宿主IFN-β產生的蛋白因子。

圖5 RLORF1基因缺失對MDV誘導宿主細胞IFN-β產生的影響

2.5RLORF1基因編碼蛋白抑制宿主細胞IFN-β的轉錄 空白CEF和轉染pEGF-N1空載體的CEF在受到Poly(I∶C)和cGAMPs刺激時IFN-β轉錄水平均明顯上調，且兩者之間無顯著差異(P>0.05)。然而，轉染pEGF-N1-RLORF1質粒的CEF在受到Poly(I∶C)和cGAMPs刺激時IFN-β的轉錄水平顯著低于轉染pEGF-N1空載體的CEF(P<0.001)(圖6)，說明MDVRLORF1基因在過表達情況下可以顯著抑制宿主細胞表達IFN-β的能力。

圖6 過表達RLORF1基因對刺激劑誘導DF-1細胞IFN-β產生的影響

3 討論

近年來，以MDV CVI988/Rispens株及MDV 814中國分離株為代表的弱毒活疫苗的大規模接種初步控制了馬立克氏病大規模暴發[15-17]。然而，鑒于MDV特殊的“潛伏-再活化”感染機制，弱毒疫苗誘導的特異性免疫反應不能徹底清除潛伏感染的MDV病毒粒子，在雞T細胞中潛伏感染的MDV會在雞免疫低下或應激時再次被激活，并經羽毛皮屑等向環境排毒，導致養殖環境中持續存在MDV強毒粒子，使得養雞業仍然面臨巨大風險[18-19]。免疫抑制導致的混合感染和繼發感染是MDV給養殖業造成巨大損失的重要原因，需要進一步揭示宿主抗MDV感染免疫機制，解決免疫抑制導致的混合感染和繼發感染問題。本試驗以MDV抑制先天性免疫反應為切入點，首次發現了MDVRLORF1編碼蛋白可以抑制宿主IFN-β的表達進而有利于病毒復制這一現象。

為研究MDVRLORF1基因在病毒感染過程中的作用，本試驗利用細菌人工染色體技術將MDV超強毒株RB1B和疫苗毒株CVI988的RLORF1基因進行缺失。MDV缺失毒CVI988ΔRLORF1和RB1BΔRLORF1均可以在CEF中復制并產生MDV典型細胞堆積樣空斑，說明在MDV超強毒株和弱毒株中RLORF1基因均為病毒復制的必需基因。HSV-1的RLORF1基因編碼蛋白ICP0缺失后，病毒同樣可以復制，但致病性和復制能力明顯減弱[20]。在本試驗中MDVΔRLORF1在CEF中形成的空斑形態典型，但空斑面積較野生型MDV明顯變小，且缺失RLORF1之后MDV復制能力比野生型MDV明顯減弱，說明RLORF1基因盡管不是MDV復制的必需基因，但在病毒復制中發揮著正向調控的作用，從功能上與α皰疹病毒的ICP0相似[21]。轉染真核表達載體pEGF-N1-RLORF1過表達RLORF1基因時，MDV的復制能力明顯強于轉染空表達載體pEGF-N1時的MDV，可見RLORF1基因過表達可以促進MDV在CEF中的復制。研究發現，α皰疹病毒多通過抑制IFN-I的抗病毒反應來增強病毒在細胞中的復制[22]。本試驗后繼檢測了RLORF1基因缺失以及過表達對病毒誘導的宿主IFN-I通路激活的影響。結果發現，MDVRLORF1基因缺失毒復制能力弱于野生型母本毒，但誘導IFN-β的能力明顯強于野生型母本毒，說明MDVRLORF1編碼蛋白在其感染過程中發揮了抑制宿主INF-β表達的作用。在病毒模擬物誘導IFN-I激活的試驗中也得到了相同的結果。病毒RNA模擬物Poly(I∶C)和cGAS激活劑cGAMPs可以用來激活CEF中的IFN-I信號通路進而上調IFN-β的轉錄[23-24]。在DF-1細胞中過表達RLORF1可以破壞Poly(I∶C)和cGAMPs對CEF IFN-I信號通路的激活，這進一步說明了MDVRLORF1基因表達產物可以抑制宿主IFN-I信號通路。盡管轉錄蛋白RLORF1抑制宿主細胞IFN-I信號通路激活的分子機制還有待進一步研究，但綜上結果表明,MDV感染過程中可通過RLORF1編碼蛋白抑制宿主IFN-I信號通路，從而有利于病毒的復制。

本試驗首次發現了MDV的RLORF1轉錄蛋白具備通過抑制IFN-β表達以增強自身復制的能力，為探明MDV感染導致宿主免疫抑制的發生機理提供參考，也為研究MDV感染機制提供了新的線索。