口蹄疫O型、A型二價3B表位缺失滅活疫苗在奶水牛的免疫效果觀察

趙鐘毅，呂 蕎，閉璟珊，文崇利，朱遠致，韋正吉，鄒聯斌 ，鄭 威，蘇姣秀，尹德瑋，鄭 敏，胡傳活

(1. 廣西大學動物科學技術學院，廣西 南寧 530005；2. 廣西動物疫病預防控制中心，廣西 南寧 530001 ；3. 中國農業科學院水牛研究所，廣西 南寧 530000)

口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病[1]。FMDV是一種單股正鏈RNA病毒，編碼4種結構蛋白(Structural proteins，SPs)VP1、VP2、VP3和VP4,以及10種非結構蛋白(Non-structural proteins，NSPs)L、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D、3AB和3ABC[2]。傳統滅活疫苗工藝步驟在于對抗原的純化以及去除包括NSPs在內的殘留污染物，但由于抗原純化不徹底，殘留的NSPs等污染物會導致傳統滅活疫苗在區分感染動物和免疫動物時存在較大的干擾[3]。口蹄疫 O型、A型二價3B表位缺失滅活疫苗(O/rV-1株+A/rV-2株)是近幾年新研發的一種基因缺失標記疫苗。與傳統滅活疫苗相比，該疫苗具有以下特點：一是抗原譜廣，通過對VP1基因上抗原表位進行人工改造，對我國目前流行的緬甸98、CATHAY、泛亞和IND2001等譜系O型毒株均能提供較強保護力；二是通過人工缺失NSP 3B上的優勢抗原表位，免疫動物不會產生該表位的抗體，因此可有效區分疫苗免疫動物和感染動物。所以應用該基因缺失苗更有利于FMD的凈化和無疫區的建設。奶水牛是廣西優勢畜牧產業，由于其個體較大，野性較強，傳統上通過采集牛食道-咽分泌液(Oesophagus-pharyngeal，OP)進行FMD病原學檢測的困難較大，因此臨床實踐中迫切需要一種更好的FMD監測方法，以及疫苗和鑒別檢測方法。

本試驗旨在評價口蹄疫 O型、A型二價3B表位缺失滅活疫苗對奶水牛臨床應用的安全性和有效性，并考察多次免疫該疫苗的動物是否仍能與感染動物有效區分，從而為開展奶牛場、種牛場FMD的凈化以及建立無FMD養殖小區和FMD無疫區探索可行的技術方法。

1 材料與方法

1.1 疫苗 口蹄疫O型、A型二價3B表位缺失滅活疫苗(O/rV-1株+A/rV-2株)(生產批號：1909001)和口蹄疫O型、A型二價滅活疫苗(O/HB/HK/99株+AF/72株)(生產批號：1911001)，由中牧股份蘭州生物藥廠提供。

1.2 檢測試劑 口蹄疫O型抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒(生產批號：20201106101-1)、口蹄疫A型抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒(生產批號：20201111103-2)、口蹄疫3ABC感染抗體檢測試劑盒(生產批號：20200804129)，均由中國農業科學院蘭州獸醫研究所生產；口蹄疫病毒通用型實時熒光RT-PCR檢測試劑盒(生產批號：FMDV20200708P)，購自哈爾濱元亨生物藥業有限公司。

1.3 試驗動物及分組 由廣西水牛研究所種牛場篩選健康狀況良好，90～100日齡，且尚未接種過任何FMD疫苗的奶水牛犢牛24頭。隨機分為2個組，一組為試驗組(12頭)，接種表位缺失疫苗，另一組為對照組(12頭)，接種常規滅活疫苗。標記每頭犢牛并記錄耳號，確保血清與耳號能一一對應。試驗組和對照組所有犢牛在同一牛舍內按照相同方式飼養。

1.4 免疫程序 為避免母源抗體干擾，根據前期抗體檢測結果，所有犢牛在90～100日齡開展首免；首次免疫(首免)后30 d進行二次免疫(二免)，二免180 d后進行三次免疫(三免)。按照疫苗說明書，首次免疫和加強免疫的接種劑量均為每頭2 mL，頸部肌內注射。

1.5 免疫安全性 所有試驗動物每次免疫后就地觀察2 h，如無異常癥狀出現則由飼養員繼續觀察，免疫后48 h內回訪1次。對所見或回訪癥狀及時記錄，除正常反應(免疫后精神沉郁、食欲減退；體溫升高1 ℃以內，不給藥2 d內恢復正常)外，出現下列癥狀之一者被視為免疫不良反應。應激反應：有較重的臨床癥狀，需要藥物治療才能恢復正常。過敏反應：免疫后短時間內出現突然倒地、口吐白沫、呼吸急促等嚴重且劇烈的反應，若治療不及時可能出現死亡，2 d內出現死亡的均歸為過敏反應死亡。

1.6 日常管理 按牛場飼養程序正常喂養和管理，定期巡查，注意觀察牛只是否出現流涎，口腔、鼻鏡、舌部、乳房、蹄部是否出現水泡、破潰等疑似FMD癥狀，若有則及時采樣檢測。

1.7 樣品采集時間 分別于首免當日，首免后30 d，二免后30、60、90、120、150 d和180 d，三免后30 d和60 d，對試驗組和對照組全體犢牛進行采血，分離血清，-20 ℃凍存，統一進行抗體檢測。分別在首免當日、二免后120 d和三免后60 d，對試驗組和對照組全體犢牛進行OP采集，-80 ℃凍存，統一進行FMD病原學檢測。

1.8 血清抗體檢測 采用口蹄疫O型、A型抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒檢測免疫抗體效價，FMD O型、A型抗體效價≥1∶128判定為免疫合格。采用口蹄疫3ABC感染抗體檢測試劑盒檢測感染抗體，阻斷率(PI)≥50%判定為FMDV NSP 3ABC抗體陽性。

1.9 FMD病原學檢測 按試劑盒說明書操作，采用熒光RT-PCR方法檢測OP中FMDV核酸。

1.10 數據處理 采用SPSS 21軟件對試驗數據進行統計分析，抗體效價用“平均值±標準差”表示。采用GraphPad Prism 8.3對試驗數據進行圖像處理和差異性比較，P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 免疫安全性檢驗 臨床觀察結果顯示，2個組所有犢牛接種疫苗后均無觀察到任何明顯的不良反應，動物各項指標正常，表明2種疫苗均安全可靠。

2.2 抗體檢測 免疫抗體檢測結果如圖1和表1所示，免疫前2個組的O型和A型平均抗體均在4.0 log2左右，各組間抗體水平差異不顯著(P>0.05)。首次接種疫苗后，2個組犢牛免疫抗體水平迅速提高；二免后免疫抗體水平進一步提高，并在二免后30 d達到高峰，試驗組和對照組O型抗體平均滴度分別為9.9 log2、8.5 log2，試驗組和對照組A型抗體平均滴度分別為9.0 log2、6.4 log2，此后逐步緩慢降低，但抗體滴度仍能維持較高水平；三免后抗體滴度再次提升，試驗組和對照組A型抗體滴度均在三免后30 d達到最高峰，平均值分別為9.8 log2和7.0 log2。從抗體合格率看，對照組首免后30 d的O型和A型免疫抗體合格率分別為33.3%、25.0%，二免后30 d及三免后30 d時O型和A型免疫抗體合格率均為75.0%、58.3%；試驗組首免后30 d的O型和A型免疫抗體合格率分別為50.0%、58.3%，二免后30 d及三免后30 d的O型和A型免疫抗體合格率均達到100%。從抗體滴度看，在免疫后各個時間點試驗組O型抗體平均滴度均顯著(P<0.05)甚至極顯著(P<0.01)高于對照組；除在首免后30 d以及二免后120 d，對照組和試驗組A型抗體平均滴度差異不顯著(P>0.05)外，在其他時間點試驗組A型抗體平均滴度均顯著(P<0.05)甚至極顯著(P<0.01)高于對照組。

表1 各組FMD滅活疫苗免疫合格率

圖1 FMD O型、A型對照組和試驗組各時段的抗體效價消長曲線

2.3 3ABC抗體檢測 分別檢測首免后30 d、二免后30 d和三免后30 d血清中3ABC抗體，如表2所示，只有對照組中1頭牛在三免后30 d檢出3ABC抗體陽性，陽性率為8.3%，其他樣品均為陰性。

表2 各組FMD NSP 3ABC抗體檢測

2.4 病原學檢測 整個試驗期間，未觀察到試驗組和對照組牛出現典型的FMD癥狀。同時，采用熒光RT-PCR方法對首次免疫當日、二免后120 d和三免后60 d采集的OP進行檢測，結果均為陰性，表明所有試驗牛均未感染FMDV。

3 討論

FMD是我國重點防控的動物疫病，其疫苗研究、生產和運用受到高度重視，科學選擇并合理使用疫苗顯得尤為重要。當前國家要求種畜養殖場開展FMD等疫病凈化，鼓勵有條件的養殖場和地區創建無疫養殖小區和無疫區，因此研制一種安全、高效，并能有效區分免疫動物和感染動物的疫苗對預防和控制FMD的流行具有十分重要的意義。

對于疫苗而言，安全性是首先需要考慮的因素。過去的FMD疫苗在臨床應用中免疫副反應較多，嚴重時可導致動物死亡，使得免疫工作受到很大影響。FMD疫苗副反應主要與疫苗中雜蛋白和內毒素的含量有關，疫苗中雜蛋白和內毒素的含量越高則越有可能導致注射后局部劇烈腫脹、不易吸收，免疫動物體溫持續升高、食欲減退或停食等副反應發生[4]。近年來，隨著疫苗生產企業工藝的改進，尤其是抗原超濾濃縮技術的廣泛應用[5]，FMD疫苗中雜蛋白和內毒素的含量大幅降低，疫苗副反應也顯著減少。本試驗發現，無論是試驗組還是對照組，犢牛在3次接種疫苗中均未出現明顯的不良反應，表明2種疫苗的安全性均良好。

免疫抗體檢測結果表明，兩組犢牛在接種疫苗后均能產生特異性免疫應答，但抗體水平存在差異。在抗體平均滴度方面，試驗組在首免后30 d、二免后30 d和三免后30 d時O型抗體平均滴度分別達到7.6 log2、9.9 log2、9.8 log2；A型抗體平均滴度分別達到6.5 log2、9.0 log2、9.8 log2；而對照組O型抗體平均滴度分別只有5.6 log2、8.5 log2、8.1 log2；A型抗體平均滴度分別只有4.9 log2、6.4 log2、7.0 log2；試驗組抗體比對照組高1.4～2.8個滴度。統計分析發現，在本試驗涉及的9個免疫后時間點試驗組O型抗體平均滴度全部顯著(P<0.05)甚至極顯著(P<0.01)高于對照組，在7個免疫后時間點試驗組A型抗體平均滴度顯著(P<0.05)甚至極顯著(P<0.01)高于對照組。試驗組在首免后30 d、二免后30 d和三免后30 d時O型、A型抗體合格率分別達到50.0%、58.3%，100%、100%和100%、100%；而對照組分別僅為33.3%、25.0%，75.0%、58.3%和75.0%、58.3%；試驗組抗體合格率比對照組高25%～41%。從抗體持續期看，試驗組在二免后180 d時O型、A型抗體平均滴度仍維持在8.8 log2和7.0 log2，抗體合格率仍高達91.7%和83.3%；而對照組O型抗體平均滴度在二免后90 d就低于7.0 log2的合格線標準。上述結果表明，無論從抗體平均滴度、抗體合格率還是抗體持續期看，試驗組均優于對照組。另外，本試驗發現首免后30 d時，盡管試驗組抗體水平優于對照組，但2個組的抗體平均合格率均未達到70.0%的群體合格標準，表明疫苗尚有改進空間，在臨床實踐中仍有必要進行加強免疫以獲得較可靠的免疫保護效果。

3ABC、2B等是FMDV增殖過程中產生的主要NSPs[6]，接種疫苗可誘導動物產生針對SPs的抗體，FMD感染動物會產生針對SPs和NSPs的抗體[7]，而FMD疫苗生產過程中上述NSPs被去除，因此疫苗免疫動物理論上不會產生NSPs抗體。近年來，FMD NSPs抗體水平是開展FMD監測凈化工作的關鍵性指標。世界動物衛生組織(OIE)規定無FMD和免疫無疫國家和地區，必須證明動物群體沒有NSPs抗體[8-9]。目前，檢測NSPs抗體也成為國內眾多養殖場戶和動物疫控機構開展FMD監測的重要手段。但是近年來發現由于工藝和成本因素限制，疫苗中始終會存在痕量NSPs，雖然新型的病毒樣顆粒亞單位疫苗[10]以及基于多表位的重組疫苗[11]均不含NSPs成分，但目前這些新式疫苗仍無法取代滅活疫苗所產生的免疫效果。在這種情況下，種畜、乳畜等飼養周期較長，疫苗殘留的NSPs在反復接種后可能在一些牲畜體內誘導產生NSPs抗體[12]，從而對監測凈化工作造成干擾。為了區分感染動物和免疫動物，將接種疫苗的動物中檢測到的NSPs抗體稱為假陽性[13]。本試驗所用的標記疫苗是一種人工缺失NSP 3B優勢表位的基因缺失苗，并有配套血清學檢測相適配。該疫苗優勢在于不需要從疫苗抗原中去除NSPs。因此能降低疫苗生產成本，還可以提高疫苗免疫效力，克服傳統疫苗的不足[14]，使用后免疫動物不會產生相應的抗體，充分滿足區分免疫動物和感染動物的需要。從本試驗結果看，常規疫苗在3次免疫后，8.3%的犢牛出現NSPs抗體。雖然該常規滅活疫苗達到了OIE對疫苗抗原純凈度檢驗(1/8以下陽性率)的要求，但仍可能會對監測評估產生不利影響。而口蹄疫O型、A型二價3B表位缺失滅活疫苗免疫動物后3ABC抗體檢測均為陰性，進一步證明該標記疫苗配合相應鑒別診斷試劑盒，能滿足區分感染動物和免疫動物的需要，從而大大簡化了FMD監測凈化工作。

本試驗在奶水牛中對2種不同FMD滅活疫苗的安全性，以及誘導的免疫抗體和NSPs抗體水平進行評估比較，證明與常規滅活疫苗相比，本試驗使用的口蹄疫O型、A型二價3B表位缺失滅活疫苗具有相同的安全性和更好的免疫保護效果，能誘導更高的抗體效價和更長的免疫持續期，并能滿足區分感染動物和免疫動物的需要。本試驗結果為進一步完善FMD監測和防控提供科學依據。