阿司匹林對高脂乳劑致大鼠骨丟失的骨形態計量學研究

張新樂，何 康，梁大紅，陳文雙，陳春玲，吳 鐵，陳光華，許碧蓮

(1.廣東醫科大學藥學院，廣東 湛江 524023；2.廣東醫科大學附屬醫院，廣東 湛江 524000)

骨質疏松癥(Osteoporosis)是一種以骨量低下、骨微結構破壞，導致骨脆性增加，易發生骨折為特征的全身性代謝性骨病，已成為全球發病率、致殘率較高且保健費用消耗很大的世紀性疾病[1]。高脂血癥是體內脂質代謝紊亂導致血脂升高的一類疾病，表現為血漿中總膽固醇(Total cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglyceride,TG)升高，高密度脂蛋白膽固醇(High-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)降低，在我國其發病率已達到41.9%[2]。研究表明，骨質疏松癥患者常伴有高脂血癥，骨量與骨髓腔內脂肪量成反比[3]，可見，骨丟失和高脂血癥是有關聯的。

阿司匹林又稱乙酰水楊酸，具有解熱鎮痛作用，兼具抗炎抗風濕等功效[4]。據2010年美國全國健康訪談調查(National Health Interview Survey)顯示，在27 157名18歲及以上的受試者中，19%的人經常服用阿司匹林(每周至少3次，持續3個月以上)。與2005年相比，經常使用阿司匹林的人數增加了57%，這可能是由于其廣泛報道的對心血管系統的保護作用[5]。鑒于阿司匹林在易骨質疏松的老年人群中廣泛使用，人們越發關注其對骨量的影響。早在1991年，Waters等通過制動模型，發現阿司匹林治療顯著降低了這些制動模型動物的骨損失率[6]。目前，研究中使用比較多的是去卵巢模擬的絕經后骨質疏松動物模型，Chen等發現阿司匹林治療組大鼠椎體骨密度(Bone mineral density,BMD)值均明顯高于去卵巢對照組，且呈劑量依賴性[7]。鑒于目前尚未見關于阿司匹林對高脂血癥所致骨質疏松的影響的報道，本試驗建立高脂乳劑模型，通過血脂和骨形態計量學數據評價模型是否成功，并觀察阿司匹林對大鼠血脂、脛骨上段(Tibial metaphysis,PTM)松質骨和脛骨中段(Tibial shaft,Tx)皮質骨的作用效果。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 總膽固醇試劑盒、甘油三酯試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇試劑盒,均購自南京建成生物工程研究所；阿司匹林，購自廣州白云山光華制藥股份有限公司，用少量乙醇促溶后用生理鹽水配至濃度為1.8 g/L；高脂乳劑由本實驗室制備(配方：每升高脂乳劑含500 g豬油、50 g膽固醇、200 mL 1,2丙二醇、10 g膽酸鈉、5 g丙硫氧嘧啶片、50 mL吐溫80)。膽固醇、膽酸鈉,均購自北京雙旋微生物培養基制品廠；丙基硫氧嘧啶，購自廣州康和藥業有限公司。

1.2 主要儀器 752紫外光柵分光光度計(上海第三分析儀器廠產品)，LEICA QW IN圖像分析儀(德國LEICA公司制造)，LEICA2155硬組織切片機(德國LEICA公司制造)。

1.3 實驗動物 3月齡SPF級SD大鼠30只，雌雄各半，體重(220±25) g，購自廣西醫科大學實驗動物中心[實驗動物生產許可證編號：SCXK(桂)2014—0002]。

1.4 試驗方法

1.4.1 試驗設計 將30只大鼠適應性喂養后隨機分為3個組，即生理鹽水(Normal saline，NS)組、高脂乳劑(High fat emulsion,HFE)組和阿司匹林(Aspirin,AP)組，每組10只。生理鹽水組正常飼養,每天用生理鹽水灌胃1 mL/(100 g·bw)，高脂乳劑組每天用高脂乳劑灌胃1 mL/(100 g·bw)，阿司匹林組每天用阿司匹林溶液[濃度1.8 g/L，0.5 mL/(100 g·bw)]和高脂乳劑[1 mL /(100 g·bw)]灌胃，連續16周。

1.4.2 血脂指標的檢測 在試驗結束前1天下午開始禁食，試驗結束時心臟取血處死大鼠，離心收集血清，按照試劑盒說明書操作檢測TC、TG、HDL-C含量。

1.4.3 骨形態計量學參數的檢測 在試驗結束后分離大鼠左側脛骨，左側脛骨上段制成不脫鈣骨切片(用硬組織切片機切成5 μm薄片)、中段骨制成不脫鈣骨磨片(手工打磨成40 μm 厚片)，進行骨組織形態計量學參數檢測。采用半自動圖像數字化分析儀測量并計算出骨的靜態參數，包括骨小梁面積百分數(%Tb.Ar)、骨小梁數量(Tb.N)、骨小梁寬度(Tb.Th)、骨小梁分離度(Tb.Sp)、破骨細胞周長百分率(%Oc.S.Pm)、每毫米破骨細胞數量(Oc.N/mm)、每平方毫米破骨細胞數量(Oc.N/mm2)、成骨細胞周長百分率(%Ob.S.Pm)、皮質骨面積(Ct.Ar)、皮質骨面積百分數(%Ct.Ar)和骨髓腔面積百分數(%Ma.Ar)。

2 結果

2.1 阿司匹林對高脂乳劑大鼠血脂的影響 由表1可知，與生理鹽水組相比，高脂乳劑組大鼠TC升高了865.0%(P<0.01)、HDL-C降低了75.7%(P<0.01)，TG雖下降，但無統計學意義(P>0.05)。結果提示，高脂乳劑灌胃可以成功建立高脂血癥動物模型。與高脂乳劑組相比，阿司匹林組大鼠TC降低了33.2%(P<0.05)、TG降低了38.1%(P<0.05)、HDL-C升高了90.3%(P<0.05)。結果表明，阿司匹林可以有效降低高血脂癥大鼠的血脂水平。

表1 阿司匹林對高脂乳劑大鼠血脂的影響

2.2 阿司匹林對高脂乳劑大鼠脛骨上段形態計量學靜態和吸收參數的影響 阿司匹林對高脂乳劑大鼠脛骨上段骨組織計量學中靜態參數%Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp和骨吸收參數%Oc.S.Pm、Oc.N/mm，骨形成參數%Ob.S.Pm的影響見圖1、圖2。與生理鹽水組相比，高脂乳劑組%Tb.Ar和Tb.N分別降低了48.6%(P<0.01)和37.8%(P<0.01)，Tb.Sp增加了83.3%(P<0.01)，而Oc.N/mm、Oc.N/mm2和%Oc.S.Pm分別增加了392.2%(P<0.01)、618.5%(P<0.01)和655.7%(P<0.01)；%Ob.S.Pm降低了32.5%(P<0.05)；由以上數據和圖3染色結果可知，高脂乳劑使大鼠脛骨上段松質骨的骨小梁顯著減少，微觀結構疏松退化，且破骨細胞的數量明顯增加，成骨細胞的數量減少。與高脂乳劑組相比，阿司匹林組的%Tb.Ar、Tb.Th 和Tb.N分別升高了76.5%(P<0.01)、19.6%(P<0.05)和50.6%(P<0.01)，Tb.Sp減少了39.8%(P<0.01)；Oc.N/mm、Oc.N/mm2和%Oc.S.Pm分別減少了74.0%(P<0.01)、78.9%(P<0.01)和73.1%(P<0.01)；%Ob.S.Pm增加了108.3%(P<0.01)；結果表明，阿司匹林可有效預防高脂乳劑對大鼠脛骨上段松質骨顯微結構的破壞，抑制骨吸收，促進骨形成。

圖1 阿司匹林對高脂乳劑大鼠脛骨上段形態計量學靜態參數的影響

圖2 阿司匹林對高脂乳劑大鼠脛骨上段骨吸收和形成參數的影響

圖3 大鼠脛骨上段5 μm切片(Masson-Goldner Trichrome 染色，10×)

2.3 阿司匹林對高脂乳劑大鼠脛骨中段皮質骨靜態參數的影響 阿司匹林對高脂乳劑大鼠脛骨中段皮質骨靜態參數Ct.Ar、%Ct.Ar、%Ma.Ar的影響見圖4、圖5。與生理鹽水組比較，高脂乳劑組大鼠的骨髓腔擴大，皮質骨面積比例下降；靜態參數%Ct.Ar下降了4.7%(P<0.01)，%Ma.Ar增加了15.3%(P<0.01)，提示高脂乳劑使大鼠脛骨中段皮質骨面積比例下降，骨髓腔變大，且均有統計學意義，說明高脂可引起大鼠皮質骨骨量丟失。與高脂乳劑組比較，阿司匹林組的%Ct.Ar增加了4.6%(P<0.05)、%Ma.Ar下降了12.5%(P<0.01)，說明阿司匹林可有效預防高脂乳劑大鼠脛骨中段皮質骨骨量丟失。

圖4 阿司匹林對高脂乳劑大鼠脛骨中段皮質骨靜態參數的影響

圖5 大鼠脛骨中段40 μm 磨片(不脫鈣骨未染色，10×)

3 討論

本試驗建立的高脂模型表現為總膽固醇升高伴高密度脂蛋白膽固醇下降，與臨床高脂血癥類似。本試驗結果顯示,高脂大鼠脛骨出現了明顯的骨丟失：(1)骨量減少：高脂乳劑組脛骨上段反映骨量變化的重要指標——骨小梁面積百分數明顯下降，松質骨丟失；脛骨中段皮質骨面積比例下降，說明皮質骨骨量減少。(2)骨顯微結構變差：高脂乳劑組骨小梁數量減少，分離度增加，表明脛骨上段松質骨的骨小梁顯著減少，微觀結構疏松退化。(3)骨吸收增加：高脂乳劑組單位面積內破骨細胞數量增加，說明骨吸收增加。(4)骨形成減少：高脂乳劑組單位面積內成骨細胞數目減少，說明骨形成減少。研究顯示，骨髓基質細胞可分化成脂肪細胞和成骨細胞，Wnt信號通路可調控骨髓基質細胞的雙向分化功能，當Wnt信號通路被中斷時骨髓基質細胞主要朝脂肪細胞分化，那么向成骨細胞分化就會減少，骨生成減少，導致骨量減少，這是脂代謝紊亂導致骨質疏松的原理[8]。

阿司匹林所具有的解熱鎮痛、抗炎、抗血小板聚集作用。最近研究顯示，阿司匹林還有抗骨質疏松的作用[9]，但其對高脂所致骨質疏松的影響未見報道，因此，本試驗通過觀察阿司匹林對血脂、骨形態計量學的影響，評價其對高脂血癥大鼠骨丟失的保護作用。試驗結果顯示，阿司匹林可以明顯降低高脂大鼠TC和TG水平，提高HDL-C水平。這與華軼男等[10]報道的阿司匹林均有一定程度的降低兔血清TC及增加HDL-C的作用的研究結果相符。阿司匹林的調脂機制可能與增加體外培養的單核-巨噬細胞B族I型清道夫受體(Scavenger receptor class B type I，SR-BI)和三磷酸腺苷結合盒轉運體A1編碼基因(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)的表達[11]有關，SR-BI通過結合HDL-C，促進總膽固醇的逆轉運。另有研究顯示，阿司匹林的調脂機制與阿司匹林抗氧化功能有關[12]。

本試驗骨形態計量學結果顯示，阿司匹林對高血脂導致的骨丟失有明顯的保護作用：(1)骨量增加：阿司匹林組大鼠骨小梁面積百分數明顯上升；脛骨中段皮質骨面積比例增加，說明皮質骨骨量增加。(2)骨顯微結構變良：阿司匹林組骨小梁數量增加，寬度增厚，分離度減少，表明脛骨上段松質骨的骨小梁變粗、變密，微觀結構疏松改善。(3)骨吸收減少：阿司匹林組單位面積內破骨細胞數目減少，說明骨吸收受到抑制。(4)骨形成增加：阿司匹林組單位面積內成骨細胞數目增加，說明促進骨形成。阿司匹林具有骨保護作用，主要是由于：一方面阿司匹林能降血脂，使骨髓基質干細胞向脂肪細胞分化受到抑制，從而促進成骨細胞前體細胞的存活和成骨細胞的分化；還能抑制核因子κB(Nuclear factor kappa-B，NF-κB)通路，減少核因子κB受體活化因子配體 (Receptor activator for nuclear Factor-κB ligand,RANKL)的表達，從而抑制破骨細胞的分化[13];另一方面，前列腺素E2(PGE2)在骨細胞中機械信號的傳導中起著重要的作用，其通過改變RANKL-OPG軸[骨保護素(Osteoprotegerin,OPG)]影響破骨細胞的形成[14]。阿司匹林抑制環氧酶(COX)從而抑制前列腺素的合成起到解熱鎮痛抗炎的作用[15]，所以阿司匹林抑制了前列腺素的合成,最終也影響了破骨細胞的形成。

綜上所述，高脂飲食會導致脂質紊亂進而造成骨量丟失。形態計量學結果顯示，阿司匹林主要是通過抑制骨吸收和促進骨形成而防止骨丟失。其抑制骨吸收可能是通過抑制RANKL的表達和抑制前列腺素E2生成，其促進骨形成可能是通過抑制骨髓基質干細胞向脂肪細胞分化。