大通牦牛與棗北黃牛肺組織發育學特點比較

秦鴻楠，周 娟，李 琳，張勤文

(青海大學農牧學院，青海 西寧 810016)

低壓低氧是高原環境的基本特征之一，對機體的機能和代謝均會產生影響。在低氧環境中高原動物為了維持正常的生理機能，機體需動員體內一系列的適應機制來提高機體攝入、運輸和利用氧氣的能力，以達到適應高原低氧環境的目的[1]。牦牛作為高原特有的大型土著動物，大多分布于海拔3 000～5 000 m 的地區，海拔3 000 m和5 000 m的大氣氧含量僅為海平面氧含量的 73%和52%[2]，在這種低氧環境下牦牛經過長時間的自然選擇和進化，其在解剖、生理和生化等方面都存在適應高原環境的可遺傳特征[3]。比如，心肺指數高、心肺發育良好是高原牦牛及其他高原土著動物的共同特點[4]。與平原黃牛相比，高原牦牛肺泡隔較厚，肺氣血屏障較薄，絕大部分是I型肺泡上皮且有間斷處，肺泡上皮為非連續型上皮[5-7]。陳秋生等[8]研究發現，高原牦牛肺臟存在良好的擴張和收縮的原因是其肺泡隔、支氣管管壁內有豐富且粗大的彈性纖維，并構成完整的彈性系統，同時各級支氣管中杯狀細胞分泌的黏液可以有效保護呼吸道的通氣量。研究表明，不同品種平原動物進入高原低氧環境，隨著動物肺血管平滑肌含量的增加，其對低氧的敏感程度也越高，這是形成“獸胸病”的組織學基礎[9]，而大通牦牛不易形成肺動脈高壓，主要是由于大通牦牛肺血管內的平滑肌含量較平原黃牛少[10]。高原牦牛在生長發育過程中，肺氣血屏障平均厚度比同日齡的平原黃牛薄，此結構特點可以降低肺泡的氣體交換阻力，同時有效增加氣體在肺泡中的交換速率[11]。

目前，牦牛肺低氧適應的組織學研究大多集中在不同海拔成年牦牛的比較，牦牛肺發育學變化雖有少量報道，但缺乏系統性和全面性，因此，本試驗選取不同發育階段的大通牦牛和棗北黃牛作為研究對象，運用 蘇木精-伊紅(Hhematoxylin-eosin,H.E.)染色、Verhoeff's Van Gieson(EVG)染色方法，觀測其肺組織的顯微結構，探討大通牦牛與棗北黃牛肺組織纖維結構的差異，從而分析大通牦牛肺組織適應高原低氧環境的發育特點，為進一步開展高原牦牛低氧適應的研究提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 選取臨床健康1日齡、30 日齡、180 日齡和成年(>600日齡)4 個年齡段的大通牦牛(海拔 3 700 m)作為研究對象，并選擇相同日齡的棗北黃牛(海拔 100 m)作為對照。

1.2 主要儀器 脫水機(Donatello)，購自DIAPATH公司；包埋機(JB-P5)、凍臺(JB-L5)，均購自武漢俊杰電子有限公司；病理切片機(RM2016)，購自上海徠卡儀器有限公司；組織攤片機(KD-P)，購自浙江金華市科迪儀器設備有限公司；烤箱(DHG-9140A)，購自上海慧泰儀器制造有限公司；正置熒光顯微鏡(Nikon Eclipse C1)、生物顯微鏡(E100)、成像系統(Nikon DS-U3)，均購自日本尼康公司；圖像采集系統(Olympus DP 70)，購自奧林巴斯(中國)有限公司。

1.3 主要試劑 無水乙醇、二甲苯、酒精蘇木素、三氯化鐵溶液、碘液、飽和苦味酸和酸性品紅，均購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.4 試驗動物處理 所有試驗動物均于棲息地現場屠宰，每組各取3頭，屠宰后于右肺心葉、膈葉相同部位取樣，4% 多聚甲醛固定，常規石蠟包埋。采用H.E.染色法觀察肺泡和肺泡隔；采用EVG 染色法顯示彈性纖維和膠原纖維。EVG 染色法：將酒精蘇木素∶三氯化鐵∶碘液按5∶2∶2 混合成 EVG 染液(提前2 d配置)，切片入 EVG 染液染 5 min，自來水沖洗；后將飽和苦味酸∶酸性品紅按9∶1混合成VG染液進行復染，透明封片。

1.5 觀察與測量 每張切片在Olympus DP 70圖像采集系統中在200倍放大倍數下選取結構完整的5個視野進行觀察并采集圖片。所有圖片用 Image-Pro Plus 5.1 Chinese 圖像分析系統測量相關數據。

1.5.1 肺泡隔厚度(Mean alveolar septum thickness,MAST)測量 采用四點十字交叉法，按公式(1)測算線上的MAST。

(1)

式中：Tai(i=1,2,3…n)表示每個肺泡隔厚度，n表示肺泡隔的數目。

1.5.2 單位面積內肺泡數(Mean alveolar number,MAN)測量 取光學顯微鏡拍攝圖片視野中的1個內切矩形，將此矩形面積作為1個單位面積(S)，S=138 295.53 μm2。以數上不數下，數左不數右的原則，按公式(2)計算MAN。

(2)

式中：Ani(i=1，2，3，…，n)為1個單位面積內的肺泡數，n表示測量圖片數目。

1.5.3 單位面積肺實質面積/單位面積 在1個單位面積內選取任意視野測量單位面積肺實質面積，每一個標本取5個視野進行測量，取測量值的平均值，計算單位面積肺實質面積/單位面積。

1.5.4 彈性纖維占比計算 利用光學顯微鏡觀察彈性纖維的分布情況，在1個單位面積內選取任意視野測量肺泡壁和血管的彈性纖維面積，每一個標本取5個視野值進行測量，取測量值的平均值，最后分別計算二者與肺泡總面積和血管實體總面積的比值，即為肺泡壁彈性纖維占比和血管彈性纖維占比。

1.5.5 血管中膜占比計算 每張切片找至少10個血管橫切面，作經過血管中點的十字交叉線，分別測量2個血管外徑(D)和4個中膜肌層厚度(t)，取其平均值，按公式(3)計算血管中膜占比。

血管中膜占比(%)=2t/D×100%

(3)

1.6 數據的統計分析 通過SPSS 23.0軟件對試驗數據進行獨立t檢驗，試驗數據以“平均值±標準誤”來表示。以P<0.05作為差異顯著性的標準。

2 結果

2.1 大通牦牛和棗北黃牛肺組織H.E.染色觀察 如圖1所示，大通牦牛肺泡呈圓形或半圓形，1日齡時，大通牦牛肺泡結構雖發育基本完善，但其肺泡大小和肺泡隔厚度不均勻(圖1A)，而棗北黃牛單位面積內肺泡數較少，肺間質面積占比較大(圖1E)；隨年齡增長，30日齡時，大通牦牛肺泡隔厚度較薄，但單位面積內肺泡數、肺間質面積占比較其余3個年齡少(圖1B)，棗北黃牛的單個肺泡面積較大，單位面積內肺泡數較30日齡大通牦牛少(圖1F)；180日齡時，大通牦牛肺泡隔厚度增厚且分布較均勻，肺間質面積占比增加(圖1C)，而棗北黃牛單位面積內肺泡數減少，單個肺泡面積增大(圖1G)；成年時，大通牦牛單位面積內肺泡數較180日齡減少，肺泡隔厚度增厚(圖1D)，而棗北黃牛單個肺泡面積較其他3個年齡明顯增大且肺泡隔厚度變薄呈線狀(圖1H)。

圖1 大通牦牛和棗北黃牛的肺組織結構(H.E.染色，200×)

2.2 大通牦牛和棗北黃牛肺組織中彈性纖維含量的比較 如圖2所示，經EVG染色后，肺組織中彈性纖維呈黑色，膠原纖維呈紅色，隨著年齡的增長，大通牦牛肺組織彈性纖維含量先減少后增多，而棗北黃牛肺組織彈性纖維含量不斷減少。

圖2 大通牦牛和棗北黃牛肺組織彈性纖維(EVG染色，200×)

2.3 大通牦牛和棗北黃牛MAST和MAN的比較 由表1可知，大通牦牛MAST隨年齡的增長而逐漸增厚；棗北黃牛的MAST出生時最厚，在成年時最薄；大通牦牛MAN隨年齡的增長呈現先增加后減少的趨勢；與棗北黃牛相比，180日齡時，大通牦牛MAN顯著小于棗北黃牛(P<0.05)，其余3個年齡大通牦牛MAN顯著大于棗北黃牛(P<0.05)。

表1 大通牦牛和棗北黃牛肺泡隔厚度和單位面積內肺泡數的比較

2.4 大通牦牛和棗北黃牛單位面積肺實質面積/單位面積和肺泡壁彈性纖維占比的比較 由表2可知，隨著年齡的增長，大通牦牛單位面積肺實質面積/單位面積先減少后增加，棗北黃牛單位面積肺實質面積/單位面積則不斷減小；30日齡時，大通牦牛單位面積肺實質面積/單位面積顯著小于棗北黃牛(P<0.05)，180日齡和成年時，大通牦牛單位面積肺實質面積/單位面積顯著大于棗北黃牛(P<0.05)。隨著年齡的增長，大通牦牛肺泡壁彈性纖維占比先減少后增多再減少，在出生時其占比最高，30日齡時最低；棗北黃牛肺泡壁彈性纖維占比不斷減少；1日齡和30日齡時，大通牦牛肺泡壁彈性纖維占比顯著小于棗北黃牛(P<0.05)，成年時，大通牦牛肺泡壁彈性纖維占比顯著大于棗北黃牛(P<0.05)。

表2 大通牦牛和棗北黃牛單位面積肺實質面積/單位面積和肺泡壁彈性纖維占比的比較

2.5 大通牦牛和棗北黃牛血管中膜占比和血管彈性纖維占比的比較 由表3可知，大通牦牛隨年齡的增加其血管中膜占比先增加后減少，且在成年時含量最低，30日齡和成年時，大通牦牛血管中膜占比顯著大于棗北黃牛(P<0.05)；大通牦牛血管彈性纖維占比隨年齡的增長呈現先減少后增加再減少的趨勢，且其含量在180日時齡最高，30日齡時最低，而棗北黃牛血管彈性纖維占比隨著年齡的增長呈現先增加后減少的趨勢，且在30日齡時含量最高，成年時含量最低，30日齡時大通牦牛血管彈性纖維占比顯著小于棗北黃牛(P<0.05)，其余3個年齡大通牦牛血管彈性纖維占比顯著大于棗北黃牛(P<0.05)。

表3 大通牦牛與棗北黃牛血管中膜占比和血管彈性纖維占比的比較

3 討論

機體對高原低氧環境的適應，主要圍繞氧氣的攝入、運輸和細胞的利用3個環節展開。而肺作為氣體交換的器官，其組織結構和功能在氧氣的攝入過程中發揮重要的作用，牦牛肺組織在長期進化過程中形成的結構特點為保證其在高原低氧環境中有充足的氧氣攝入提供了重要的組織學保障。

肺泡隔由肺泡壁毛細血管和其周圍的肺氣血屏障構成，本試驗表明大通牦牛肺泡隔厚度隨著年齡增長逐漸增厚，結合本課題組前期研究[9-11]得到的大通牦牛較平原黃牛有較薄的肺氣血屏障的結果，牦牛肺組織有較多的肺泡壁毛細血管是導致肺泡隔厚度增加的主要原因，較薄的肺氣血屏障可使肺氣體交換過程中阻力減小，較多的肺泡壁毛細血管可增加肺氣體交換速率，而本試驗結果中，隨年齡增長，180日齡時肺泡壁彈性纖維增加也是導致肺泡隔厚度增加的另一個原因，彈性纖維的數量增加，可增加肺泡的彈性回縮力，為肺的良好換氣提供重要保障，由于成年時大通牦牛逐漸適應了低氧環境，因此大通牦牛的肺泡壁彈性纖維占比減少。陳秋生等[8]在成年牦牛的研究中也發現，牦牛肺泡隔、支氣管管壁內都存在豐富且粗大的彈性纖維，構成完整的彈性系統。其他學者在藏羊中研究也發現，藏羊肺泡隔厚度顯著厚于小尾寒羊，藏羊肺泡隔內毛細血管較小尾寒羊豐富，多呈開放狀態且管徑較粗，肺泡隔內彈性纖維粗大且數量多[12-14]，也證明了高原土著動物肺組織具有肺泡隔較厚、毛細血管較多和彈性纖維較多的特點。肺泡隔、支氣管管壁內都存在有豐富的彈性纖維并構成完整的彈性系統，可以使肺臟處于良好的擴張和收縮狀態，保證肺內氣體有效的排出。

本試驗結果顯示，在大通牦牛發育過程中，30日齡是一個相對特殊的階段，主要表現為此階段有較高的單位面積內肺泡數、較低的肺泡壁彈性纖維和血管彈性纖維占比的特點，此結果與魏青[5]的研究結果一致，結合本課題組前期研究[5-6]，大通牦牛在30日齡肺泡進入快速發育階段，其單位面積內肺泡數急劇增多，這在肺切片觀察中得到證實。本試驗中，隨年齡增長，肺泡壁彈性纖維和血管彈性纖維占比的增加，導致肺實質面積占比增加和單位面積內肺泡數逐漸減少。

已有研究認為，隨著肺血管平滑肌含量的增加，動物對于低氧的敏感程度也逐漸增加[15]。在本試驗中，大通牦牛血管中膜占比較棗北黃牛豐富，且差異顯著(P<0.05)，主要原因可能是大通牦牛肺血管內平滑肌含量有利于動脈的射血及血液循環，更好的維持牦牛的肺血液循環量。這與靳新花等[16]報道的研究結果一致，其認為成年牦牛肺血管內平滑肌含量豐富。

綜上所述，與棗北黃牛相比，大通牦牛隨年齡的增長，其肺泡隔厚度增厚、肺泡壁彈性纖維占比和血管彈性纖維占比先降低后升高再降低，單位面積內肺泡數和血管中膜占比先增加后減少。這些肺顯微結構的特點是大通牦牛適應高原低壓低氧環境的組織學基礎。