基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS代謝組學技術篩選不同基原小檗皮品種鑒別的指標性成分

徐鑫梅，杜 歡，易 歡，武鑫玥，馮 圖，蔣桂華，范 剛

基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS代謝組學技術篩選不同基原小檗皮品種鑒別的指標性成分

徐鑫梅1，杜 歡1，易 歡1，武鑫玥1，馮 圖2*，蔣桂華1，范 剛3*

1. 成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 611137 2. 貴州工程應用技術學院生態工程學院，貴州 畢節 551700 3. 成都中醫藥大學民族醫藥學院，四川 成都 611137

研究不同基原小檗皮藥材（甘肅小檗Schneid.、鮮黃小檗Maxim.、匙葉小檗Schneid.和刺紅珠Franch.）的整體化學成分差異，篩選品種鑒別的指標性成分。采用超高效液相色譜-串聯四級桿靜電場軌道阱質譜（UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS）代謝組學技術，分析不同基原小檗皮藥材的整體化學成分，結合主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘判別分析（partial least-squares discrimination analysis，PLS-DA）和方差分析篩選不同基原鑒別的化學標志物。共鑒定了47個化學成分，包括24個生物堿類、12個有機酸類及其衍生物、5個糖類及其衍生物，以及6個其他類成分。篩選出藥根堿、四氫巴馬汀、蟾毒色胺內鹽等12個化學標志物。UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS代謝組學技術結合化學計量學方法，可有效闡明小檗皮不同基原藥材的化學成分差異，為其品種鑒別和質量控制提供了參考依據。

小檗皮；甘肅小檗；鮮黃小檗；匙葉小檗；刺紅珠；UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS；代謝組學；品種鑒定；化學標志物；藥根堿；四氫巴馬汀；蟾毒色胺內鹽

小檗皮為小檗科植物甘肅小檗Schneid.及其同屬多種植物的干燥莖皮或根皮[1]，是藏醫治療糖尿病及其并發癥的常用藥材。小檗皮為典型的多基原藏藥材，同屬多種植物均能入藥，課題組前期調查發現目前各藏醫院及藥材市場上使用的小檗皮主流品種為甘肅小檗Schneid.、鮮黃小檗Maxim.、匙葉小檗Schneid.和刺紅珠Franch.[2]。小檗皮基原的多樣性和混淆使用不利于市場監管，也影響其質量穩定性和可控性。因此，采用現代科學技術篩選可鑒別小檗皮不同基原品種的化學標志物，對于其品種鑒定和質量控制具有重要的意義。

近年來，代謝組學技術已廣泛運用于植物藥材的整體成分分析、品種鑒別和質量評價等研究中。超高效液相色譜-串聯四級桿靜電場軌道阱質譜（UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS）具有高分辨率、高靈敏度的方法學優勢，特別適用于植物藥材多成分復雜體系的分析[3]。小檗皮藥材主要含有小檗堿、木蘭花堿、蟾毒色胺內鹽等成分，課題組前期采用HPLC和1H-NMR技術定性定量分析了小檗皮藥材中的部分化學成分[4-5]，但仍然缺乏全面的定性表征。因此，本研究采用基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS的代謝組學技術，從整體上對小檗皮不同基原藥材的化學成分進行定性分析，并結合主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘判別分析（partial least-squares discrimination analysis，PLS-DA）和方差分析，篩選可鑒別不同基原小檗皮的化學標志物，以期為小檗皮藥材的品種鑒別和質量評價提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Q-ExactiveTMOrbitrap高分辨質譜儀、VanquishTM超高液相色譜儀、Compound Discoverer 3.0工作站、Xcalibur 2.1工作站（美國Thermo-Fisher公司）；CQ-250型超聲波清洗器（上海必能信有限公司）；SartoriusBP121s型電子天平（北京賽多利斯科學儀器公司）。

1.2 試劑

對照品蟾毒色胺內鹽、阿魏酸4--β--吡喃葡萄糖苷為本課題組自制，HPLC檢測質量分數均＞99%；對照品木蘭花堿（批號M-026-181122）、小檗紅堿（批號X-061-181129）和去亞甲基小檗堿（批號Y-126-180426）均購自成都瑞芬思生物科技有限公司，質量分數均＞98%；對照品藥根堿（批號Y-023-141201）、巴馬汀（批號H-015-150808）和小檗堿（批號Y-035-150818）均購自四川賽因斯特生物科技有限公司，質量分數均＞98%；色譜純甲醇、甲酸購自美國Thermo-Fisher公司；分析純甲醇購自成都市科隆化學品有限公司；蒸餾水購自廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

本研究共收集21批小檗皮藥材，采用植物分類學及課題組前期建立的DNA條形碼方法[2]，經成都中醫藥大學范剛教授鑒定為小檗科植物刺紅珠Franch.、甘肅小檗Schneid.、匙葉小檗Schneid.和鮮黃小檗Maxim.，具體信息見表1。

表1 小檗皮樣品信息

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

取小檗皮粉末（過3號篩）0.1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入20 mL甲醇，稱定質量，密塞，超聲（250 W、40 kHz）處理30 min，放冷，用甲醇補足減失的質量，搖勻濾過，取續濾液過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.2 對照品溶液的制備

取對照品蟾毒色胺內鹽、阿魏酸4β吡喃葡萄糖苷、木蘭花堿、藥根堿、巴馬汀、小檗紅堿、小檗堿、去亞甲基小檗堿對照品適量，精密稱定，分別制成質量濃度為0.41、0.47、0.62、0.62、0.55、0.44、0.48、0.51 μg/mL的對照品溶液，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相為甲醇（A）-0.1%甲酸溶液（B）；梯度洗脫：0～20 min，5%～80% A；20～30 min，80%～95% A；30～35 min，95%～95% A；體積流量0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量2 μL。

2.4 質譜條件

參照課題組前期建立的質譜條件[6]。采用HESI離子源，正離子檢測模式，電噴霧電壓為＋3000 V；負離子檢測模式，電噴霧電壓為?3000 V；鞘氣體積流量為35 arb；輔助氣體積流量為10 arb；毛細管溫度為320 ℃；二級質譜采用Full MS/dd-MS2掃描模式，Full MS分辨率為70 000，dd-MS2分辨率為17 500，掃描范圍100～1500。

2.5 數據處理與分析

將質譜原始數據導入Compound Discoverer 3.0軟件中，對其進行譜峰提取、保留時間校正、峰對齊及噪音信號去除等預處理。預處理后的質譜數據信息與mzClond和mzVault數據庫進行匹配，通過數據庫中精準的相對分子質量以及二級質譜碎片離子對化合物進行歸屬和鑒定。同時查閱ChemSpider、Pubchem、Scifinder等在線數據庫并結合相關文獻報道檢索化合物可能的化學結構式和裂解碎片，對鑒定的成分進行比對和驗證，進一步排除假陽性結果。將預處理的數據矩陣導入SIMCA-P 14.1軟件，對不同基原小檗皮進行PCA以及PLS-DA分析，并采用單因素方差分析進行驗證。同時，運用MetaboAnalyst 5.0軟件對化學標志物進行聚類熱圖分析，觀察差異成分在不同基原小檗皮藥材中的分布情況。

3 結果與分析

3.1 小檗皮化學成分的鑒定

根據“2.1”項下方法制備供試品溶液，按照建立的UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS方法對21批小檗皮樣品進行分析。將質譜數據信息預處理后，檢索數據庫進行匹配，并與文獻報道中的碎片離子信息進行比對驗證，共鑒別了47個化學成分。小檗皮中主要含有氨基酸、有機酸、糖類等初級代謝產物，以及生物堿等次級代謝產物。其中包含24個生物堿類成分，主要為異喹啉類生物堿，如小檗堿、巴馬汀、藥根堿、小檗紅堿、去亞甲基小檗堿等；12個有機酸類成分及其衍生物，如奎寧酸、哌啶酸、蘋果酸等；5個糖類及其衍生物，包括-葡萄糖胺、葡萄糖酸、果糖、蔗糖和海藻糖，其他類成分6個，包括焦谷氨酸、脯氨酸、腺嘌呤、鳥苷、刺五加苷E和lariciresinol 4-- glucoside。鑒定的化合物具體質譜裂解信息見表2。

表2 小檗皮化學成分質譜鑒定結果

續表2

*表示與對照品比對鑒定

*It indicates the comparison and identification with the references

3.2 不同基原小檗皮的圖譜比較

取不同基原小檗皮樣品，根據“2.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”“2.4”項下色譜質譜條件進行測定，得到不同基原小檗皮藥材在正、負離子模式下全掃描總離子流圖，見圖1。通過直觀分析，可以看出4個基原品種小檗皮藥材的整體化學成分輪廓大致相同，但其部分信號峰的強度不同，表明不同基原小檗皮的化學成分雖然相似，但成分在含量上有一定差異。

3.3 基于模式識別比較小檗皮不同基原藥材的化學成分差異

將原始質譜數據通過Compound Discoverer 3.0預處理后，將數據矩陣導入SIMCA-P軟件進行PCA分析，選擇標度化方法為帕累托法，其PCA得分圖如圖2-A所示。結果顯示，匙葉小檗和甘肅小檗在t[2]軸上呈現明顯分離，刺紅珠、鮮黃小檗和甘肅小檗較為接近，3組散點交互存在，有部分重疊，沒有達到明顯分離。

為了消除樣品組內差異的影響，進一步采用PLS-DA方法進行判別分析。由二維得分圖（圖2-B）可以看出，匙葉小檗和刺紅珠、甘肅小檗、鮮黃小檗得到明顯分離，而刺紅珠、甘肅小檗和鮮黃小檗仍存在少量重疊，不能得到明顯區分。此外，三維得分圖（圖2-C）展示了21個樣本的空間分布情況，不同基原小檗皮明顯聚集為4類，小檗皮4種基原藥材在三維圖譜中得到了較為明顯分離，表明小檗皮不同品種間的化學成分存在一定的差異。

圖1 小檗皮4種基原的正(A)、負(B) 離子模式總離子流圖

圖2 不同基原小檗皮PCA得分圖(A)、PLS-DA二維得分圖(B)、三維得分圖(C)和PLS-DA載荷圖(D)

3.4 可鑒別小檗皮不同基原品種的指標性成分篩選

為了篩選可鑒別小檗皮4種基原的化學標志物，進一步創建小檗皮的PLS-DA載荷圖（圖2-D）。由載荷圖可以看出，藥根堿、小檗堿、四氫巴馬汀、-甲基四氫巴馬汀、蟾毒色胺內鹽、8-氧化小檗堿等成分可能是引起小檗皮不同品種間差異的主要成分。此外，采用預測變量重要性VIP對成分進行表征。VIP值較大的被認為是區分4種基原小檗皮的主要潛在化學標志物。根據變量重要性篩選出VIP＞3的變量共16個，包括藥根堿、四氫巴馬汀、-甲基四氫巴馬汀、小檗堿、蟾毒色胺內鹽、8-氧化小檗堿、巴馬汀、刺五加苷E、木蘭花堿、阿魏酸、去亞甲基小檗堿、oblongine、蟾毒色胺、海藻糖、去甲異紫堇定和阿魏酸4-β-吡喃葡萄糖苷。

由于PLS-DA無法確定觀察到的差異成分是否具有統計學意義，因此需要采用方差分析進一步驗證。以各成分的歸一化峰面積為指標，采用單因素方差分析評價這些成分在小檗皮4種基原間的差異是否具有顯著性。結果顯示，小檗皮4種基原藥材中藥根堿、四氫巴馬汀、-甲基四氫巴馬汀、蟾毒色胺內鹽、8-氧化小檗堿、巴馬汀等12種成分存在顯著性差異（圖3）。因此，這12種成分為化學標志物，可為小檗皮藥材的品種鑒別以及質量控制提供參考。

*P＜0.05 **P＜0.01

3.5 指標性成分的熱圖分析

為了更直觀觀察12個化學標志物在小檗皮4種基原藥材中的分布情況，采用MetaboAnalyst 5.0對12個差異成分進行聚類熱圖分析，結果見圖4。圖中深紅棕色到深藍色顏色的變化反映了差異成分在小檗皮不同基原藥材中的分布情況，其中紅棕色越深代表該成分的相對含量越高，相反藍色越深則表示該成分的相對含量越低。結果表明，熱圖分析與方差分析結果呈現基本一致。從圖中可以看出匙葉小檗含有更多的藥根堿、四氫巴馬汀、-甲基四氫巴馬汀、蟾毒色胺內鹽、阿魏酸和阿魏酸4-β-吡喃葡萄糖苷；甘肅小檗藥材中去亞甲基小檗堿、8-氧化小檗堿、海藻糖、巴馬汀和阿魏酸和阿魏酸4-β-吡喃葡萄糖苷相對較多；刺紅珠藥材中的刺五加苷E、去甲異紫堇定和巴馬汀較多，而阿魏酸和阿魏酸4-β-吡喃葡萄糖苷較少；鮮黃小檗藥材中去甲異紫堇定和蟾毒色胺內鹽較多。

圖4 小檗皮4種基原差異成分的熱圖分析

4 討論

近年來，高分辨質譜技術已被廣泛應用于藥材的分析研究中，UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS代謝組學技術以其高靈敏度、高分辨率、質量范圍寬、動態范圍廣[3]等特點，可以準確獲得微量化合物的質譜信息，快速鑒定化合物結構，尤其適用于對照品缺乏的化學成分篩查，在藥材的品種鑒別和質量控制等方面展現出獨特的優勢。本研究從整體代謝物角度出發，建立了快速鑒定小檗皮藥材化學成分的方法，較為全面地反映整體代謝成分，結合模式識別分析方法篩選出不同基原小檗皮的化學標志物，為小檗皮不同品種鑒別和質量評價提供一種可靠準確的參考方法。盡管基于高分辨質譜的代謝組學技術已得到快速發展，但未知代謝成分的鑒定策略仍極具挑戰。藥材中存在許多同分異構體的化合物，其二級碎片離子、裂解規律都極為相似，若缺乏文獻的核實以及對照品的比對，很難將其進行區分鑒定。在今后的研究中還需進一步對小檗皮中的成分進行分離鑒定，不斷健全完善小檗皮的化學成分數據庫。

本研究采用UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS代謝組學技術對小檗皮4種基原藥材的整體化學成分進行快速全面檢測分析，共鑒定了47種化學成分，主要包括氨基酸、核苷酸、有機酸、糖類等初級代謝產物，以及生物堿等次級代謝產物。同時，采用PCA、PLS-DA等模式識別方法，發現小檗皮不同基原之間的化學成分存在一定差異，結合方差分析，進一步篩選出藥根堿、四氫巴馬汀、蟾毒色胺內鹽等12個化學標志物，這些研究結果對于小檗皮4種不同基原品種的鑒定、質量控制與評價等研究都具有十分重要的意義。

熱圖分析結果顯示，12個化學標志物在小檗皮不同基原藥材中分布不均。與鮮黃小檗和刺紅珠比較，匙葉小檗和甘肅小檗藥材中含有更多的藥根堿、四氫巴馬汀等成分。現代研究表明，藥根堿具有降血糖、調血脂、抗炎等作用[15-16]，四氫巴馬汀具有明顯的降糖、抗心律失常等生物活性[17]。因此，由于這些有效成分的相對含量不同，小檗皮不同基原藥材的質量很可能存在差異，表明這4個品種在臨床上作為同一藥材使用可能并不合理，今后應進行進一步的質量評價研究，為小檗皮不同基原品種的臨床合理應用提供參考依據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Selection of indicative components for identification of different species ofbased on UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS metabolomics

XU Xin-mei1, DU Huan1, YI Huan1, WU Xin-yue1, FENG Tu2, JIANG Gui-hua1, FAN Gang3

1. School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 2. School of Ecological Engineering, Guizhou University of Engineering Science, Bijie 551700, China 3. School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China

To study the differences in the overall chemical composition of different species of(,,, and), and to select the chemical markers for species identification.Ultra high performance liquid chromatography-Q-exactive orbitrap-mass spectrometry (UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS) metabolomics was used to analyze the overall chemical composition of different species of, combined with principal component analysis (PCA), partial least square discriminant analysis (PLS-DA) and variance analysis to select chemical markers for identification.A total of 47 chemical components were identified, including 24 alkaloids, 12 organic acids and their derivatives, 5 sugars and their derivatives, and 6 other components. Twelve chemical markers, such as jatrorrhizine, tetrahydropalmatine and bufotenidine, were screened out.UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS metabonomics combined with chemometric methods can effectively clarify the chemical composition differences of different species of, and provide a reference for the identification and the quality control of.

;Schneid.;Maxim.;Schneid.;Franch.; UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS; metabolomics; species identification; indicative components; jatrorrhizine; tetrahydropalmatine; bufotenidine

R286.2

A

0253 - 2670(2022)23 - 7524 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.23.024

2022-05-07

國家自然科學基金項目（81874370）；四川省重點研發項目（2022YFS0434）；貴州省科技計劃項目（黔科合基礎-ZK[2021]一般090）；貴州省教育廳科技拔尖人才支持計劃項目（黔教合KY字[2018] 072）

徐鑫梅，碩士，主要從事中藥品種、品質與資源開發研究。Tel: (028)61800160 E-mail: 1483773389@qq.com

通信作者：范 剛，教授，主要從事民族藥質量控制及藥效物質基礎研究。Tel: (028)61800160 E-mail: fangang1111@163.com

馮 圖，教授，主要從事藥用植物學研究。Tel: (0857)8330068 E-mail: 58689136@qq.com

[責任編輯 時圣明]