華南忍冬花蕾中1個(gè)新的單萜苷類化合物

王團(tuán)委，王振中，王秋紅，耿劍亮, 4*

? 化學(xué)成分 ?

華南忍冬花蕾中1個(gè)新的單萜苷類化合物

王團(tuán)委1, 2, 3，王振中2, 3，王秋紅1，耿劍亮1, 2, 3, 4*

1. 廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006 2. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，中藥制藥過程新技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222001 3. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，中藥提取精制新技術(shù)重點(diǎn)研究室，江蘇 連云港 222001 4. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023

研究華南忍冬干燥花蕾（山銀花）的化學(xué)成分。綜合應(yīng)用HP-20、硅膠、ODS、Sephadex LH-20和半制備液相等多種色譜學(xué)方法進(jìn)行分離純化，并根據(jù)化合物的理化性質(zhì)和核磁共振波譜數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。采用LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7模型，以抑制炎性細(xì)胞因子一氧化氮（NO）的分泌為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)分離得到的化合物進(jìn)行體外抗炎活性評(píng)價(jià)。從華南忍冬干燥花蕾70%乙醇提取物中分離鑒定了5個(gè)化合物，分別為8-[α--arabinopyranosyl- (1′′→6′)-β--glucopyranosyl]-2,6-dimethyloct-1,2′′-lactone（1）、天師酸（2）、黃麻脂肪酸F（3）、天師酸甲酯（4）和黃麻脂肪酸F甲酯（5）。化合物1為新的單萜苷類化合物，命名為忍冬單萜A，化合物2～5為首次從忍冬屬植物中分離得到?；衔飳?duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中NO的分泌均無顯著的抑制作用。

華南忍冬；山銀花；一氧化氮；8-[α--arabinopyranosyl-(1′′→6′)-β--glucopyranosyl]-2,6-dimethyloct-1,2′′-lactone；忍冬單萜A；天師酸；黃麻脂肪酸F；天師酸甲酯

山銀花又名山花、南銀花、土忍冬、土銀花等，為忍冬科（Caprifoliaceae）忍冬屬Linn.植物灰氈毛忍冬Hand.-Mazz.、紅腺忍冬Miq.、華南忍冬DC.或黃褐毛忍冬Hsu et S. C. Cheng的干燥花蕾或帶初開的花，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效，臨床上主要用于治療用于癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒、溫病發(fā)熱[1]。主要分布于我國四川、廣東、廣西、湖南等南方各地。山銀花的化學(xué)成分多樣，主要含有皂苷類[2-8]、有機(jī)酸類[9-15]、黃酮類[16-17]、環(huán)烯醚萜苷[18-20]、揮發(fā)油[21-22]等，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明山銀花提取物及其化學(xué)成分具有抗菌抗病毒[23-26]、抗氧化[27-29]、解熱抗炎[30-32]、抗腫瘤[33-34]和保肝[35-38]等多種藥理活性。金銀花和山銀花作為我國清熱解毒常用中藥，《中國藥典》2005年版之前均將金銀花和山銀花收載為金銀花使用，直至《中國藥典》2005年版才將二者分別收載。而山銀花的產(chǎn)量高、花期長(zhǎng)、價(jià)格低廉，種植規(guī)模大，資源豐富。但目前關(guān)于山銀花的藥理學(xué)研究主要集中于粗提物或有效部位的藥效評(píng)價(jià)，缺乏對(duì)山銀花中所含化學(xué)成分及藥理作用的系統(tǒng)深入研究。為了給山銀花在醫(yī)藥、化工、食品、飲料工業(yè)等方面的應(yīng)用價(jià)值和安全性作出科學(xué)的評(píng)價(jià)和提供質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，合理開發(fā)和利用這一豐富的自然資源，故對(duì)山銀花中的化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)研究，為制定山銀花藥材及相關(guān)中成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

為進(jìn)一步探索山銀花的有效成分，本實(shí)驗(yàn)綜合應(yīng)用HP-20、硅膠、ODS、Sephadex LH-20和半制備液相等多種色譜學(xué)方法，對(duì)華南忍冬干燥花蕾70%乙醇提取物經(jīng)石油醚、醋酸乙酯和正丁醇萃取得到的醋酸乙酯部位的化學(xué)成分進(jìn)行研究，從中分離得到5個(gè)化合物，分別鑒定為8-[α--arabinopyranosyl- (1′′→6′)-β--glucopyranosyl]-2,6-dimethyloct-1,2′′- lactone（1）、天師酸（tianshic acid，2）、黃麻脂肪酸F（corchorifatty acid F，3）、天師酸甲酯（tianshic acid methyl ester，4）和黃麻脂肪酸F甲酯（corchorifatty acid F methyl ester，5）。化合物1為新的單萜苷類化合物，命名為忍冬單萜A；化合物2～5均為首次從忍冬屬植物中分離得到。采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7模型，以抑制炎性細(xì)胞因子一氧化氮（NO）的分泌為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)分離得到的化合物進(jìn)行體外抗炎活性評(píng)價(jià)。

1 儀器與材料

Brucker AVANCE 600型核磁共振儀（德國Bruker公司），F(xiàn)inni-gan LCQ Advantage MAX質(zhì)譜儀，Waters Snapt G2 mass spectrometer高分辨質(zhì)譜儀，Shimadzu分析高效液相色譜（Shimadzu LC-6AD series pump equipped with a UV detector），Shimadzu制備型高效液相色譜，P2000旋光測(cè)定儀、FT/IR-480 plus紅外光譜儀（KBr壓片）、JASCOV-550 紫外-可見光譜儀（日本Jasco公司）。分析高效液相色譜柱為Phenomenex Gemini（C18，250 mm×4.6 mm，5 μm），制備高效液相色譜柱為C18柱（250 mm×20 mm，5 μm，Nacalai tesque Inc.，日本）。TS100型倒置顯微鏡（日本尼康公司）；A10051560型超凈工作臺(tái)（AIRTECH公司）；ZW-A型微量振蕩器（常州國華儀器有限公司）；L530型離心機(jī)（湘儀集團(tuán)）；S25型小舞靈旋渦混合器（德國IKA公司）；EDP3-plus電動(dòng)多道移液器（美國RAININ公司）；1000、200、20、10 μL單道移液器（Brand公司）。

薄層硅膠GF254和柱色譜硅膠（青島海洋化工廠），HP-20大孔樹脂（Mitsubishi-Chemical，日本），反相ODS填料（Merck公司），Sephadex LH-20填料（Amersham Biosciences公司），Toyo-pearl HW-40填料（Toyo Soda MFG）；95%乙醇（食用級(jí)，連云港長(zhǎng)和酒業(yè)有限公司），水（三蒸水，自制），分析純?cè)噭暇┗瘜W(xué)試劑有限公司）。DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基（Hyclone），胎牛血清（Lonsera），LPS（南京大治生物科技有限公司），二甲基亞砜（DMSO，阿拉丁試劑），24孔細(xì)胞培養(yǎng)板（JET公司），96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（JET公司），0.25%胰酶細(xì)胞消化液（Gibco），NO檢測(cè)試劑盒：NaNO2，Griess 試劑II＋Griess試劑II（上海碧云天）；亞硝酸鈉（南京化學(xué)試劑股份有限公司）。單糖標(biāo)準(zhǔn)品-Glc（批號(hào)C10911131，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%，Macklin公司）、-Glc（批號(hào)E1506024，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，Aladdin公司）、-Ara（批號(hào)C14635692；質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，Macklin公司）、-Ara（批號(hào)J24M10R89091；質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，上海源葉生物有限公司）。

山銀花藥材于2021年購自安徽亳州（產(chǎn)地湖南溆浦），藥材經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)吳啟楠教授鑒定為忍冬科植物華南忍冬DC.的干燥花蕾，樣品標(biāo)本（20210506）現(xiàn)保存于江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司標(biāo)本室。

2 提取與分離

山銀花干燥花蕾10 kg，8倍量70%乙醇加熱回流提取3次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮之后，得流浸膏7 L。總浸膏用適量水分散均勻后，1次用石油醚、醋酸乙酯和正丁醇進(jìn)行萃取，分別得到石油醚部位（151 g，LC-1）、醋酸乙酯部位（283 g，LC-2）和正丁醇部位（246 g，LC-3）。取醋酸乙酯部位LC-2（240 g）進(jìn)行硅膠柱色譜（φ 8.5 cm×100.0 cm）分離，二氯甲烷-甲醇（100∶0、98∶2、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、0∶100）梯度洗脫得到共11個(gè)餾份Fr. 2A～2K。Fr. 2H（11.9 g）經(jīng)ODS柱色譜（φ 80.0 cm×5.0 cm）分離，甲醇-水（2∶8、4∶6、6∶4、7∶3、10∶0）梯度洗脫得到Fr. 2H1～2H9，2H6（3.2 g）經(jīng)制備液相（50%乙腈-酸水，體積流量8 mL/min，示差檢測(cè)器RID）純化得到化合物2（101.2 mg，R＝21 min）、3（93.2 mg，R＝14 min）、4（23.0 mg，R＝23 min）和5（50.3 mg，R＝17 min）。2I（12.8 g）經(jīng)ODS柱色譜（φ 5.0 cm×80.0 cm）分離，甲醇-水（2∶8、4∶6、6∶4、7∶3、10∶0）梯度洗脫得到Fr. 2I1～2I11，2I8（4.2 g）經(jīng)硅膠柱色譜（φ80.0 cm×5.0 cm）分離，氯仿-甲醇（100∶0、98∶2、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、0∶100）梯度洗脫得到Fr. 2I1～2I9，2I5經(jīng)半制備液相（25%乙腈-酸水，體積流量4 mL/min，208 nm）純化得到化合物1（11.8 mg，R＝15 min）。

3 糖的絕對(duì)構(gòu)型的鑒定

3.1 單糖標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)的方法[39]，對(duì)單糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行衍生化反應(yīng)，反應(yīng)過程見圖1。取單糖標(biāo)準(zhǔn)品混合物（-Glc、-Glc、-Ara、-Ara，各0.5 mg），加入左旋半胱氨酸甲酯（-cysteine methyl ester，1 mg）和吡啶（1 mL），置于60 ℃下反應(yīng)1 h。再加入鄰甲苯異硫氰酸酯（-tolyl isothiocyanate，1 μL），繼續(xù)在60℃下反應(yīng)1 h。反應(yīng)完成后，混合物直接作為供試品，以進(jìn)行HPLC分析。

圖1 醛糖與左旋半胱氨酸甲酯和鄰異硫氰酸酯的反應(yīng)

3.2 化合物的水解及衍生化反應(yīng)

取化合物（約1 mg），加入2 mol/L HCl (2 mL)，置于80～90℃水浴中反應(yīng)1 h。將混合物蒸干，加入1 mL水混懸，再加入等體積的水飽和的氯仿萃取。取水層，蒸干，用與單糖對(duì)照品一樣的方法進(jìn)行衍生化反應(yīng)，得到HPLC供試品。

HPLC分析條件：色譜柱Phenomenex Gemini（C18，250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為25%乙腈（0.1%甲酸）；體積流量0.8 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm；檢測(cè)時(shí)間40 min。

3.3 結(jié)果

通過對(duì)比化合物水解得到的糖基衍生物和單糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生物在HPLC圖譜中的保留時(shí)間確定化合物結(jié)構(gòu)中所含有的糖基類型，結(jié)果見圖2。化合物1所含糖基類型為-Glc和-Ara。

圖2 化合物1的糖基衍生物與單糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生物HPLC對(duì)比圖

4 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色無定形粉末，[α]29 D?36.8（0.50，CH3OH）。HR-ESI-MS給出/465.233 9 [M＋H]+（計(jì)算值為465.233 6），確定分子式為C21H36O11，計(jì)算不飽和度為4。UV（甲醇）圖譜可見max(log): 204 (3.6), 230 (3.3)。IR (KBr) 光譜給出max: 3418, 2929, 2358, 1715, 1064 cm?1。

1H-NMR (600 MHz, CD3OD) 圖譜，低場(chǎng)區(qū)顯示見2個(gè)糖端基質(zhì)子信號(hào) [H4.50 (1H, d,= 6.8 Hz), 4.21 (1H, d,= 8.0 Hz)]，高場(chǎng)區(qū)可見2個(gè)甲基氫信號(hào)[H1.15 (3H, d,= 7.0 Hz, 9-CH3), 0.91 (3H, d,= 6.6 Hz, 10-CH3)]。13C-NMR (150 MHz, CD3OD) 結(jié)合DEPT-135譜共顯示21個(gè)碳信號(hào)，包括11個(gè)糖殘基的碳信號(hào)、1個(gè)季碳信號(hào) (C178.3)、2個(gè)次甲基 (C40.4, 29.7)、5個(gè)亞甲基 (C68.9, 37.4, 37.1, 35.5, 24.9)、2個(gè)甲基 (C21.5, 18.4)，推測(cè)結(jié)構(gòu)中可能存在單萜結(jié)構(gòu)片段。由1H-1H COSY譜（圖3），可觀察到H-9/H-2/H-3/H-4/H-5/H-6/H-10以及H-6/H-7/H-8之間存在明顯相關(guān)，結(jié)合H3-9 (H1.15)/C-1 (C178.3), C-2 (C40.4), C-3 (C35.5) 的HMBC相關(guān)，進(jìn)一步確證了結(jié)構(gòu)中存在單萜結(jié)構(gòu)片段。

圖3 化合物1的主要1H-1H COSY () 和HMBC ()相關(guān)

化合物的1D核磁圖譜中顯示結(jié)構(gòu)中含有2分子糖殘基，對(duì)其進(jìn)行糖水解衍生化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明化合物1所含2個(gè)糖基分別為-Glc和-Ara（圖2），結(jié)合糖端基質(zhì)子信號(hào) [H4.50 (1H, d,= 6.8 Hz), 4.21 (1H, d,= 8.0 Hz)] 中的偶合常數(shù)提示葡萄糖端基碳構(gòu)型為β構(gòu)型，阿拉伯糖端基碳為α構(gòu)型。在HMBC譜中，可見H-1′′ (H4.50)/C-6′ (C68.5) 和H-6′ (H4.15, 3.65)/C-1′′ (C101.5) 相關(guān)，提示阿拉伯糖基和葡萄糖基為1→6連接，此外，可見相關(guān)峰H-2′′ (H5.03)C-1 (C178.3) 和H-8 (H3.76, 3.71)/C-1′ (δ104.4) （圖3），提示單萜結(jié)構(gòu)片段分別連接在阿拉伯糖基的2位和葡萄糖基的1位。

綜合NMR圖譜信息，歸屬了化合物1的碳?xì)湫盘?hào)（表1）。鑒定化合物1的結(jié)構(gòu)為8-[α-- arabinopyranosyl-(1′′→6′)-β--glucopyranosyl]-2,6- dimethyloct-1,2′′-lactone；經(jīng)SciFinder Scholar網(wǎng)絡(luò)檢索，未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報(bào)道，表明化合物1為1個(gè)新的單萜苷類化合物，命名為忍冬單萜A（圖4）?；衔锏慕^對(duì)構(gòu)型有待進(jìn)一步確定。

化合物2：白色無定形粉末，HR-ESI-MS給出/331.248 3 [M＋H]+（計(jì)算值為331.248 4），確定分子式為C18H34O5，計(jì)算不飽和度為2。1H-NMR (600 MHz, C5D5N): 2.46 (2H, m, H-2), 1.60 (2H, m, H-3), 1.26～1.34 (6H, m, H-4～6), 1.46 (2H, m, H-7), 4.47 (1H, m, H-8), 6.27 (1H, dd,= 15.6, 5.5 Hz, H-9), 6.32 (1H, dd,= 15.6, 5.8 Hz, H-10), 4.44 (1H, m, H-11), 3.88 (1H, m, H-12), 1.78 (2H, m, H-13), 1.53～1.76 (8H, m, H-14～17), 0.81 (3H, m, CH3-18)；13C-NMR (150 MHz, C5D5N): 176.2 (C-1), 35.0 (C-2), 25.8 (C-3), 26.3 (C-4), 29.9 (C-5), 26.3 (C-6), 38.6 (C-7), 72.1 (C-8), 136.8 (C-9), 131.0 (C-10), 75.4 (C-11), 76.3 (C-12), 33.8 (C-13), 30.1 (C-14), 29.6 (C-15), 32.5 (C-16), 23.2 (C-17), 14.5 (C-18)。氫譜、碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)一致[40]，故鑒定化合物2為天師酸。

表1 化合物1的核磁數(shù)據(jù)(600/150 MHz, CD3OD)

圖4 化合物1的結(jié)構(gòu)

化合物3：白色無定形粉末，HR-ESI-MS給出/329.232 6 [M＋H]+（計(jì)算值為329.232 8），確定分子式為C18H32O5，計(jì)算不飽和度為3。1H-NMR (600 MHz, C5D5N): 2.28 (2H, t,＝7.3 Hz, H-2), 1.59 (2H, m, H-3), 1.33 (8H, m, H-4～7), 1.50 (2H, m, H-8), 4.48 (1H, m, H-9), 6.31 (1H, dd,= 15.6, 5.6 Hz, H-10), 6.38 (1H, dd,= 15.5, 6.0 Hz, H-11), 4.54 (1H, t,= 5.8 Hz, H-12), 4.00 (1H, m, H-13), 2.34 (1H, m, H-14a), 2.10 (3H, overlapped, H-14b, 17), 5.85 (1H, m, H-15), 5.50 (1H, m, H-16), 0.93 (3H, t,= 7.5 Hz, CH3-18)；13C-NMR (150 MHz, C5D5N): 176.3 (C-1), 35.1 (C-2), 26.0 (C-3), 26.3 (C-4), 30.0 (C-5), 29.8 (C-6), 30.2 (C-7), 38.7 (C-8), 72.1 (C-9), 136.9 (C-10), 131.1 (C-11), 75.6 (C-12), 75.7 (C-13), 31.9 (C-14), 133.2 (C-15), 127.3 (C-16), 21.3 (C-17), 14.7 (C-18)。氫譜、碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)一致[41]，故鑒定化合物3為黃麻脂肪酸F。

化合物4：白色無定形粉末，HR-ESI-MS給出/345.263 9 [M＋H]+（計(jì)算值為345.264 1），確定分子式為C19H36O5，計(jì)算不飽和度為2。1H-NMR (600 MHz, C5D5N) 顯示1組反式雙鍵信號(hào)H6.32 (1H, d,= 15.6, 5.8 Hz), 6.27 (1H, dd,= 15.5, 5.5 Hz)，1個(gè)甲氧基信號(hào)H3.62 (3H, s)，1個(gè)甲基信號(hào)H0.81 (3H, m)，3個(gè)羥基偕氫H4.47 (1H, m), 4.44 (1H, m), 3.88 (1H, m)。13C-NMR (150 MHz, C5D5N) 圖譜共顯示19個(gè)碳信號(hào)，結(jié)合DEPT 135圖譜，發(fā)現(xiàn)共含有1個(gè)季碳信號(hào) (C176.2)、5個(gè)次甲基碳信號(hào) (C136.8, 131.1, 76.4, 75.4, 72.0)、11個(gè)亞甲基碳信號(hào)(C38.6, 35.0, 33.8, 32.5, 30.1, 29.9, 29.7, 26.4, 26.2, 25.8, 23.2)、1個(gè)甲氧基碳信號(hào)(C51.5)、1個(gè)甲基碳信號(hào)(C14.5)。將化合物4的核磁數(shù)據(jù)與2對(duì)比發(fā)現(xiàn)4僅多出1個(gè)甲氧基信號(hào)[H3.62 (3H, s);C51.5]，其他數(shù)據(jù)一致[40]，故鑒定化合物4為天師酸甲酯。

化合物5：白色無定形粉末，HR-ESI-MS給出/343.248 0 [M＋H]+（計(jì)算值為343.248 1），確定分子式為C19H34O5，計(jì)算不飽和度為3。1H-NMR (600 MHz, C5D5N) 顯示2組雙鍵信號(hào)H6.38 (1H, dd,= 15.5, 6.0 Hz, H-11), 6.31 (1H, dd,= 15.6, 5.6 Hz, H-10), 5.85 (1H, m, H-15), 5.50 (1H, m, H-16)，1個(gè)甲基信號(hào)H0.93 (3H, t,= 7.5 Hz, CH3-18)，1個(gè)甲氧基信號(hào)H3.62 (3H, s, CH3)，3個(gè)羥基偕氫H4.54 (1H, t,= 5.8 Hz, H-12), 4.48 (1H, m, H-9), 4.00 (1H, m, H-13)。13C-NMR (150 MHz, C5D5N)圖譜共顯示19根碳信號(hào)，結(jié)合DEPT-135圖譜，發(fā)現(xiàn)共含有1個(gè)季碳信號(hào) (C176.3)，7個(gè)次甲基碳信號(hào) (C136.9, 133.2, 131.1, 127.3, 75.7, 75.6, 72.1)，9個(gè)亞甲基碳信號(hào) (C38.7, 35.1, 31.9, 30.2, 30.0, 29.8, 26.3, 25.9, 21.3)，1個(gè)甲基碳信號(hào) (C14.7)，1個(gè)甲氧基碳信號(hào) (C51.6)。將化合物5的1H-NMR、13C-NMR數(shù)據(jù)與3對(duì)比發(fā)現(xiàn)5僅多出1個(gè)甲氧基信號(hào)[H3.62 (3H, s, CH3),C51.6]，其他數(shù)據(jù)一致[41]，故鑒定化合物5為黃麻脂肪酸F甲酯。

5 化合物體外抑制NO釋放活性

5.1 細(xì)胞活力測(cè)試

RAW 264.7細(xì)胞在37 ℃的培養(yǎng)箱中以含有10% FBS和1% PS的DMEM培養(yǎng)基為基質(zhì)培養(yǎng)至細(xì)胞密度為2×105個(gè)/mL。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞均勻接種于96孔板中（每孔400 μL），樣品組中加入分別加入50、20、10 μmol/L藥物，對(duì)照組加入等量無血清的DMEM培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，于多功能酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm吸光度（）值。

5.2 炎癥因子NO測(cè)試

取RAW 264.7 細(xì)胞均勻接種于96 孔板中（終密度2.5×105個(gè)/mL），繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后吸去上清液。模型組和樣品組中加入LPS（終質(zhì)量濃度為1 μg/mL），對(duì)照組中加入等量無血清的DMEM 培養(yǎng)基，樣品組中藥物的終濃度為50、20、10 μmol/L。24 h 后取50 μL 上清液，加入Griess A 試劑和Griess B 試劑各50 μL。在酶標(biāo)儀上540 nm 處測(cè)定最終產(chǎn)物的值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算亞硝酸鹽濃度并按公式計(jì)算抑制率。

抑制率＝(模型組NO平均含量－樣品組NO平均含量)/(模型組NO平均含量－對(duì)照組NO平均含量)

5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各化合物在其測(cè)試濃度下對(duì)RAW 264.7 細(xì)胞均無細(xì)胞毒性。各化合物對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO的分泌均無顯著抑制作用，抑制率均低于2.05%。

6 討論

金銀花和山銀花作為我國清熱解毒常用中藥，其功能主治相同、化學(xué)成分相似，但目前的研究多集中于金銀花，而山銀花的藥理學(xué)研究主要集中于粗提物或有效部位的藥效評(píng)價(jià)，缺乏對(duì)山銀花中所含化學(xué)成分及其藥理作用的系統(tǒng)深入研究，不利于明確和區(qū)分二者的臨床應(yīng)用價(jià)值以及山銀花自然資源的合理開發(fā)利用。另一方面山銀花與金銀花的主要差異性成分，是三萜及皂苷類成分，其在山銀花藥材中的含量也相對(duì)較大，但目前市售來自山銀花的三萜皂苷類化學(xué)對(duì)照品品種單一（僅有灰氈毛忍冬皂苷甲、乙和川續(xù)斷皂苷乙），因而本實(shí)驗(yàn)整體研究思路是對(duì)山銀花中三萜及皂苷類富集部位進(jìn)行系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，首先進(jìn)行采用溶劑萃取法進(jìn)行粗分離得到水部位、醋酸乙酯部位和正丁醇部位。經(jīng)過HPLC及UPLC-Q/TOF-MS分析，山銀花中三萜及皂苷類成分主要富集在醋酸乙酯部位，因此本研究首先對(duì)醋酸乙酯部位進(jìn)行系統(tǒng)的研究，為山銀花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供標(biāo)準(zhǔn)品。后續(xù)本課題組將繼續(xù)對(duì)山銀花中的主要成分（三萜及皂苷類成分）進(jìn)行規(guī)?；苽?，并結(jié)合山銀花的功能主治建立合理的藥效評(píng)價(jià)模型對(duì)分離得到的化合物進(jìn)行活性評(píng)價(jià)，建立山銀花與功效相關(guān)聯(lián)的指紋圖譜，提供山銀花鑒別用指標(biāo)成分標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法，為山銀花藥材及相關(guān)中成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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不同小波基以及分解層去噪后Rs,n對(duì)比如圖4所示.在db小波族中，db7去噪后的Rs,n相比其它dbN小波基高；當(dāng)小波基達(dá)到最佳分解層后，若繼續(xù)對(duì)信號(hào)進(jìn)行分解，分解后的信噪比會(huì)下降，說明分解層不是多越好.在sym小波族中，sym9去噪后信號(hào)的Rs,n明顯高于symN的其它小波基.根據(jù)表3統(tǒng)計(jì)db7和sym9部分分解層去噪后Rs,n指標(biāo)，使用小波基db7對(duì)波峰屬于高斯峰的帶噪信號(hào)7層分解處理后的質(zhì)量最好.

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A new monoterpene glycoside from

WANG Tuan-wei1,2, 3, WANG Zhen-zhong2, 3, WANG Qiu-hong1, GENG Jian-liang1, 2, 3, 4

1. School of Traditional Chinese Medicine Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China 2. State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Kanion Pharmaceutical Co., Ltd.,Lianyungang 222001, China 3. Key Laboratory for the New Technique Research of TCM Extraction and Purification, Kanion Pharmaceutical Co., Ltd.,Lianyungang 222001, China 4. Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China

To study the constituents from the dried flower buds of.The compounds were isolated and purified by column chromatography of HP-20 macroporous resin, silica gel, ODS, Sephadex LH-20, and semi-preparative RP-HPLC. Their structures were elucidated by physicochemical properties and spectral analyses. Taking NO as the evaluating indicator, the model of LPS-induced RAW264.7 cells was used to evaluate theanti-inflammatory activity of isolates.Five compounds were isolated and identified from the 70% ethanol extract of, including 8-[--arabinopyranosyl-(1′′→6′)-β--glucopyranosyl]-2,6-dimethyloct-1,2′′-lactone (1), tianshic acid (2), corchorifatty acid F (3)、tianshic acid methyl ester (4) and corchorifatty acid F methyl ester (5), respectively.Compound 1 is a new monoterpene glycoside, named comfusanoside A. Compounds 2—5 are identified fromfor the first time. All the isolates had no significant inhibitory effect on NO secretion in RAW264.7 cells stimulated by LPS.

DC.;; NO; tianshic acid; 8-[α--arabinopyranosyl-(1′′→6′)-β--glucopyranosyl]-2,6-dimethyloct-1,2′′-lactone;comfusanoside A; tianshic acid; corchorifatty acid F; tianshic acid methyl ester

R284.1

A

0253 - 2670(2022)23 - 7317 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.23.001

2022-07-23

國家中醫(yī)藥管理局中央財(cái)政轉(zhuǎn)移支付地方項(xiàng)目：基于重點(diǎn)研究室研究領(lǐng)域的中醫(yī)藥多學(xué)科研究能力提升項(xiàng)目-中藥提取精制新技術(shù)

王團(tuán)委，男，本科，研究方向?yàn)橹兴幖疤烊凰幬锏幕钚猿煞盅芯?。E-mail:wtwang007@126.com

通信作者：耿劍亮，博士，研究方向?yàn)橹兴幖疤烊凰幬锘钚猿煞盅芯?、代謝組學(xué)研究。E-mail: gengjianliang8521@126.com

[責(zé)任編輯 王文倩]