基于生物信息學探討肝癌相關細胞焦亡基因及潛在中藥預測

張道平，姚昆鵬，劉起立，李崢嶸，陳沛儒，彭建平, 2*

·數據挖掘與循證醫學·

基于生物信息學探討肝癌相關細胞焦亡基因及潛在中藥預測

張道平1，姚昆鵬1，劉起立1，李崢嶸1，陳沛儒1，彭建平1, 2*

1. 湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208 2. 湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007

探究肝癌患者的細胞焦亡基因與預后的相關性以及細胞焦亡差異基因的相關性，并預測調控差異表達基因的中藥，通過分析中藥的性味歸經、藥物分類探討治療肝癌患者細胞焦亡的中醫理論，為中醫藥現代化提供新思路。下載TCGA數據庫中肝癌患者的轉錄組數據，以關鍵詞“pyroptosis”搜索GenCards數據庫，獲取細胞焦亡相關基因并篩選、分析其在肝癌的表達量、共表達情況，并進行預后分析、基因本體論（gene ontology，GO）功能富集分析、DO（diease ontology）疾病分析；再通過CTD數據庫查找對基因有調控作用的化學成分。最后應用COREMINE數據庫查找相關中藥，并統計高頻中藥的性味歸經、藥物分類。共篩選出16個與預后相關的細胞焦亡基因，其中11個基因有較多相關的中藥，其中高頻中藥為茶樹根、郁金、人參、丁香、干姜等；藥性以寒、溫為主；藥味以苦、甘為主；歸經以肝、肺經居多；以補虛藥、清熱藥、化痰止咳平喘藥、解表藥、理氣藥和活血化瘀藥為主。通過生物信息學技術分析得出肝癌相關細胞焦亡基因及對應的高頻中藥，為治療肝癌的中藥新藥開發及中醫藥理論的微觀挖掘提供思路。

細胞焦亡；肝癌；中醫藥；生物信息學；中藥新藥開發；茶樹根；郁金；人參；丁香；干姜

原發性肝癌（primary hepatic carcinoma，PHC）是全球第6大常見癌癥，也是世界上死亡率最高的癌癥之一[1]，肝癌患者的死亡率很高，全世界每年報告死亡人數近80萬[2]。目前對于肝癌的治療方法通常為手術切除、肝移植、序貫射頻消融（radiofrequency ablation，RFA）、肝動脈化療栓塞（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）和靶向治療、免疫治療等[3]。靶向治療如索拉非尼能夠延長晚期肝癌患者的生存時間，然而其不良反應以及耐藥性限制了肝癌的臨床療效[4]。而由于腫瘤的免疫微環境錯綜復雜，故單抗法治療的緩解率并不理想[5]，因此逆轉耐藥、誘導癌細胞死亡則是未來的可能方向之一。近年來，細胞死亡是一個研究熱點，其分為壞死、細胞焦亡、鐵死亡等[6]。腫瘤細胞中細胞焦亡的發生，可以增強化療效果，逆轉耐藥，而中醫藥作為天然藥物，其活性成分治療則具有低毒性、安全、多靶點等優點，并且其能夠影響細胞焦亡的進程[7-8]，因此研究中醫藥調控細胞焦亡基因表達有重要意義，其不僅在從中藥活性成分中開發抗肝癌藥物方面作用顯著，還可通過網絡藥理學以及現代醫學的研究方法豐富中醫理論。

1 資料與方法

1.1 數據來源

從TCGA網站中下載肝癌（liver hepatocellular carcinoma，LIHC）的轉錄組數據，用于基因表達量分析；在GeenCards數據庫中得到細胞焦亡的相關基因名稱；使用Gene Expression Profiling Interactive Analysis（GEPIA）數據庫進行基因的預后分析；使用R語言進行基因本體論（gene ontology，GO）、DO（diease ontology）分析；使用Comparative Toxicogenomics Database（CTD）數據庫查找可調控目標基因的化學成分。最后通過COREMINE數據庫查找包含化學成分的中藥，并統計性味歸經以及藥物分類。

1.2 方法

1.2.1 差異基因分析 使用R語言ver 4.0.5分析肝癌轉錄組測序數據，獲得在肝癌中細胞焦亡相關基因的表達量，并繪制細胞焦亡差異基因在正常組與腫瘤組的熱圖。

1.2.2 基因共表達網絡 將細胞焦亡差異基因以差異倍數（fold change，FC）的對數值（logFC）降序排列，選取前10與后10位差異基因進行相關性分析并繪制共表達熱圖。

1.2.3 關鍵基因臨床相關分析 使用GEPIA數據庫分析細胞焦亡基因表達水平與肝癌的生存時間的相關性。

1.2.4 GO功能富集分析 將得到的細胞焦亡基因進行GO富集分析，分析基因產物承擔的生物學過程、執行功能時所處的細胞結構位置。

1.2.5 DO疾病分析 將得到的細胞焦亡基因進行DO疾病分析，分析基因與其余疾病相關程度。

1.2.6 中藥預測與分析 將細胞焦亡基因提交至CTD數據庫，查找能夠調控基因的化學成分，經規范后統計對應中藥較多的11種基因，查找文獻并且參考CTD數據庫文獻支持數較多的化學成分，在COREMINE數據庫中尋找包含對應化學成分的中藥名稱。根據《中國藥典》《中藥大辭典》《中華本草》《中藥學》對中藥的性味歸經以及藥物分類進行統計。

2 結果

2.1 細胞焦亡差異基因分析

以“pyroptosis”為關鍵詞在GeenCards數據庫中搜索，得到細胞焦亡相關基因，并提取基因在肝癌以及正常組織中的表達量，選取＜0.001的基因，篩選出86個上調基因和19個下調基因，繪制細胞焦亡相關基因熱圖，如圖1所示。圖中左邊藍色部分為正常組，右邊粉色部分為腫瘤組，紅色為高表達基因，藍色為低表達基因。從圖1中可看出，細胞焦亡基因在腫瘤組多為高表達。

2.2 基因相關性分析

將細胞焦亡的差異基因進行相關性分析，以logFC值降序排列，選取差異基因中前后排名前10的基因進行相關性分析，如圖2所示。圖中橫縱坐標均為基因的名稱，上半部分是通過圓圈的大小和顏色深淺代表相關性，藍色越深，代表在研究中2個基因之間正相關性越強，最高為1；紅色越深則代表負相關越強，最高為?1。下半部分則直接通過數值代表相關系數。由圖2可知，20種基因的相關性最高相關系數為0.37，最低相關系數為?0.26，表明細胞焦亡相關基因仍有正負相關。

***P＜0.001

2.3 細胞焦亡相關基因預后分析

在105個基因中保留logFC在1.0以上及?1.0以下的部分，得到53個細胞焦亡基因，將其提交至GEPIA數據庫，進行肝癌臨床生存分析，將＜0.05的基因保留，稱為預后相關基因，并繪制臨床生存分析圖，如圖3所示。說明細胞焦亡基因的表達量與肝癌的生存時間有明顯相關。

圖2 細胞焦亡基因相關性分析

2.4 細胞焦亡GO富集分析

將得到的肝癌中差異表達的細胞焦亡基因進行GO富集分析。選取矯正后＜0.05，并分別在生物過程（biological process，BP）、細胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）中排名前10位的功能繪制GO富集分析圖（圖4），圖中以圓圈大小和顏色深淺反映富集程度以及矯正后值大小，由結果可知，篩選出的細胞焦亡基因在BP中與脂多糖反應、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、白細胞介素等炎癥反應相關；在CC中主要與膜、受體相關；在MF中主要與半胱氨酸酶、細胞死亡等過程有關。

2.5 細胞焦亡相關基因DO疾病分析

將得到的肝癌中差異表達的細胞焦亡基因進行DO疾病分析，選取矯正后＜0.05的疾病，并以矯正后值升序排序，選取前30位相關疾病，并繪制DO富集分析圖，如圖5所示，圖中左側為疾病名稱，右側底部數字代表富集在本疾病中的基因數目。由圖5可知，細胞焦亡相關基因與多種疾病有關，其中多為感染、炎癥等相關疾病。

2.6 預后相關基因對應中藥統計

將與預后相關的細胞焦亡基因提交至CTD數據庫，檢索對于基因有調控作用的化學成分，查閱文獻以及選擇CTD數據庫中文獻支持度較高的化學成分。將化學成分提交至COREMINE數據庫，檢索包含對應化學成分的中藥，選擇＜0.05的中藥，共篩選出1223味中藥，出現頻次9377次。根據《中國藥典》《中藥大辭典》《中華本草》《中藥學（第10版）》等工具書對于出現頻次在10次以上的中藥進行統計，共篩選出324味中藥。由于部分藥物沒有明確的性味歸經，故對于中藥的不同屬性進行分別統計。四氣301次，寒（96）＞溫（89）＞平（80）＞涼（30）＞熱（6），如圖6所示；五味475次，苦（151）＞甘（133）＞辛（103）＞澀（35）＞酸（24）＞咸（19）＞淡（10），如圖7所示；歸經：肝（123）＝肺（123）＞脾（107）＞胃（96）＞腎（70）＞心（61）＞大腸（54）＞膀胱（22）＞膽（10）＞小腸（7）＞心包（6）＞三焦（2），如圖8所示。有明確藥物分類的中藥共154味，補虛藥（29）＝清熱藥（29）＞化痰止咳平喘藥（13）＞解表藥（10）＝理氣藥（10）＞活血化瘀藥（9）＞利水滲濕藥（8）＝收澀藥（8）＝止血藥（8）＞溫里藥（7）＞祛風濕藥（4）＝瀉下藥（4）＞化濕藥（3）＝平肝熄風藥（3）＝消食藥（3）＞安神藥（2）＝驅蟲藥（2）＞攻毒殺蟲止癢藥（1）＝開竅藥（1），如圖9所示。進一步選擇B淋巴細胞瘤-2相關X蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X protein，）、bcl-2同源拮抗劑殺手蛋白（Bcl-2 antagonist killer 1，）、核苷酸結合寡聚結構域1（nucleotide-binding oligomerization domain 1，）基因單獨進行歸經（頻次）統計，結果表明與肺（124）、肝（123）、脾（106）、胃（96）、腎（70）相關性最強；與肺（109）、肝（108）、脾（95）、胃（82）、腎（60）相關性最強；與肺（37）、胃（34）、肝（33）、脾（30）、腎（15）相關性最強，如圖10所示。部分基因對應的中藥見表1，部分高頻中藥見表2。

A—P分別對應基因ACE2、ANXA2、APIP、BAK1、BAX、BSG、CDKN2B-AS1、CHMP3、CTSV、DHX9、GLMN、GSDMC、METTL3、MKI67、NOD1、TREM2的生存曲線圖

圖4 細胞焦亡基因GO功能富集分析

圖5 細胞焦亡基因DO富集分析

圖6 中藥四氣統計分析

圖7 中藥五味統計分析

圖8 中藥歸經統計分析

圖9 中藥功效分類統計分析

圖10 3種基因歸經統計雷達圖

表1 部分基因相關的調控成分及代表中藥

表2 部分高頻中藥

3 討論與展望

調節性細胞死亡（regulated cell death，RCD）在生理情況下又稱程序性細胞死亡（programmed cell death，PCD）。其中包括幾種死亡方式，如細胞凋亡、自噬、鐵死亡等[9]。其中細胞焦亡是一種特殊的細胞死亡形式，其過程依賴半胱氨酸天冬氨酸酶-1（cysteine aspartase-1，Caspase-1）、消皮素D（gasdermin D，GSDMD）等分子導致細胞腫脹破裂，細胞內容物釋放，進而產生強烈的炎癥反應[10-11]。研究表明，細胞焦亡對于脂肪肝、肝硬化、肝癌等肝臟疾病均為重要因素[12-13]。而在形成肝癌前，細胞焦亡產生的炎性小體及因子能促進肝癌的發展；在肝癌形成以后，細胞焦亡水平下調，或可促進肝癌的發展[14]。然而，細胞焦亡在腫瘤中的作用仍有很大爭議[15]，有待進一步研究。細胞焦亡可被多種方式誘導發生，如化療藥物、細菌內容物、病毒感染、人體的部分調節因子等[16]，其過程則有經典及非經典途徑，經典途徑細胞焦亡主要通過Caspase-1調控，非經典途徑細胞焦亡則通過Caspase-4/5/11通路調控[17-18]；同時還有Caspase-3、Caspase-8等途徑[19]。BAK、Bax的激活不僅可直接介導肝炎，而且可在化療誘導通過BAK/Bax-Caspase-3-消皮素E（gasdermin E，GSDME）途徑介導細胞焦亡[20-22]。多被認為是一種抑癌基因[23]，當高表達時，Caspase-3可切割引發細胞焦亡，細胞焦亡增強了藥物敏感性，降低了腫瘤細胞的抗凋亡特性，增強療效[21]，故而BAX-Caspase-3-GSDME通路在腫瘤的發育和治療中起著重要的作用。NOD1則與炎癥、免疫密切相關，且與多種腫瘤中的細胞焦亡過程以及診斷、預后相關[24-25]。

中藥單體成分以及中藥復方均可調控細胞焦亡，如丹皮酚預處理可下調核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NLR family pyrin domain containing 3，NLRP3）/Caspase-1介導的細胞焦亡過程，保護心肌組織[26]；積雪草酸能夠協同增強奧沙利鉑對結腸癌細胞的增殖抑制、促凋亡、自噬、細胞焦亡作用[27]。而中藥復方研究，如大黃牡丹湯可抑制NLRP3/Caspase-1通路，治療炎癥性腸病[28]。有學者研究細胞焦亡的病理生理過程，將肝癌發生發展過程中的免疫功能降低與中醫理論中“正虛”、增殖轉移與“癌毒”、血液高凝狀態與“瘀血”相互結合，提出“虛瘀毒”理論與肝癌細胞焦亡的關系，并提出益氣化瘀解毒類中藥可能會影響細胞焦亡過程而發揮作用[29]。

本研究通過分析TCGA數據庫肝癌細胞焦亡差異基因的表達，得到能夠調控基因的化學成分，并通過化學成分查找相關中藥，總結中藥性味歸經及藥物分類，最后將3種基因通過化學成分與中醫理論相結合，得出與肝癌細胞焦亡有關的四氣為寒、溫、平；五味為苦、辛、甘為主；說明對于肝癌本身，祛邪多應用苦寒藥物，而扶正方面則注重以辛甘化陽法補虛，辛味藥不僅在人體正虛時促進陰陽互長互生，更可使苦寒藥物達到寒而不滯的效果，避免寒涼傷正。整體歸經統計以肝、肺、脾、胃、腎經為主。基因與歸經的相關性分析發現，單個基因與疾病整體歸經趨勢大致相同，可說明微觀基因層面與宏觀整體調控變化相一致。而單個基因歸經中肺經藥物出現頻率大于肝經，但差距不大，其可能原因是中醫理論中氣機升降由肝肺二者共同所主，許多理氣藥及化痰藥常歸經于肺經，而胃經多于肝經，可能是與中醫理論中“胃氣”相關性較強所致，后續有待進一步分析。藥物分類統計以補虛藥、清熱藥、化痰藥、解表藥、理氣藥、活血化瘀藥、利水滲濕藥為主。其藥物對應的病機與中醫理論中對于肝癌的病機認識大致相同，以此或可證明中醫性味歸經、藥物分類理論有明確的物質基礎。

本研究通過細胞焦亡差異表達基因探尋相關的中藥，并將基因與歸經進行關聯，發現微觀層面的基因與中醫整體觀念指導下的用藥是一致的，可以從微觀和宏觀層面進一步豐富中醫理論，并深入挖掘中醫經典中可能存在的微觀機制。因此，這2個層面的互相印證對于完善和發展中醫藥理論有重要意義。然而本研究仍存在以下不足：（1）本研究僅統計頻數在10次以上的中藥名稱及性味歸經、藥物分類，或可進一步擴大統計范圍；（2）本研究通過調控成分統計相關中藥，但其是否能夠調控細胞焦亡仍需進一步進行實驗驗證及臨床觀察。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Exploration of pyroptosis genes in liver cancer related cells based on bioinformatics and prediction of potential traditional Chinese medicine

ZHANG Dao-ping1, YAO Kun-peng1, LIU Qi-li1, LI Zheng-rong1, CHEN Pei-ru1, PENG Jian-ping1, 2

1. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 2. First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, China

To explore the correlation between cell pyroptosis gene and prognosis in patients with liver cancer, as well as the correlation of differential genes of cell pyroptosis, and to predict the traditional Chinese medicine for regulating differential expression genes. The traditional Chinese medicine theory for the treatment of cell pyroptosis in patients with liver cancer was discussed through the nature, taste and meridian attribution of traditional Chinese medicine and drug classification. To provide new ideas for modernization of traditional Chinese medicine.The transcriptome data of liver cancer patients were downloaded from the TCGA database, and the keywords “pyroptosis” were used to search the GenCards database to obtain pyroptosis related genes, screen and analyze their expression levels and co-expression in liver cancer, and perform prognostic analysis, gene ontology (GO) functional enrichment analysis, DO (disease ontology) disease analysis; Then CTD database was used to find the chemical components that had regulatory effects on genes. Finally, the COREMINE database was used to find traditional Chinese medicines, and the the nature, taste, meridian attribution and classification of traditional Chinese medicines were counted.A total of 16 cell pyroptosis genes related to prognosis were screened out, of which 11 genes were more corresponding to traditional Chinese medicine. The high-frequency traditional Chinese medicine was obtained as follows: Chashugen (root of), Yujin (), Renshen (et), Dingxiang (), Ganjiang (), etc. The medicinal properties were mainly cold and warm; Medicine taste were mainly bitter and sweet; Liver and lung meridian were the main channels. It was mainly used as medicine for tonifying deficiency, clearing heat, reducing phlegm, relieving cough and antiasthmatic, relieving surface, regulatingand promoting blood circulation and removing blood stasis.Through the analysis of bioinformatics technology, the pyrodeath genes related to liver cancer and the corresponding high-frequency traditional Chinese medicine were obtained, providing ideas for the development of new traditional Chinese medicine for the treatment of liver cancer and the micro-mining of traditional Chinese medicine theory.

pyroptosis; liver cancer; traditional Chinese medicine; bioinformatics; development of new Chinese materia medica; root of;;et;;

R285

A

0253 - 2670(2022)23 - 7467 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.23.018

2022-05-13

國家中醫臨床研究基地業務建設項目第二批科研專項（JDZX2015183）；湖南省自然科學基金（2022JJ30458）；長沙市自然科學基金（kq2202451）

張道平（1997—），男，在讀碩士研究生，主要從事中醫藥防治肝病。E-mail: 416367611@qq.com

通信作者：彭建平（1979—），女，博士，副主任醫師，碩士生導師，主要從事中醫藥防治肝病。E-mail: jppeng@126.com

[責任編輯 潘明佳]