周斌研究組揭示心臟損傷修復中冠狀動脈的新來源及形成過程

近日，中國科學院分子細胞科學卓越創新中心研究員周斌研究組以“Dual Genetic Lineage Tracing Reveals Capillary to Artery Formation in the Adult Heart”為題，在Circulation上在線發表研究成果。該研究利用雙同源重組酶介導的遺傳譜系示蹤技術高效且清晰地記錄成體心臟損傷過程中毛細血管形成冠狀動脈的過程，揭示了毛細血管動脈化在成體心肌缺血模型中的重要作用，為受損心臟的血管修復和治療提供了新的研究方向，為心血管再生醫學提供了新思路。

冠狀動脈疾病一直是全人類致死率最高的疾病之一。冠狀動脈一旦發生病變，將阻礙血液有效流向心肌，導致心肌組織缺乏必需的氧氣和營養物質，從而引發心肌梗死。如何使病變的冠狀動脈再度發揮血流作用（血運重建）或者刺激新的冠狀動脈生成一直是該領域研究者努力的方向。支架植入和冠狀動脈旁路移植技術的開發與發展使得血運重建成為可能，挽救了部分患者的生命。側支動脈的形成為新生期梗死的心臟提供血流，從而緩解心臟衰竭。然而，有一定數量的患者由于身體原因不能接受血運重建的治療，而側支動脈的形成目前仍受限于新生期。因此，深入探究新生冠狀動脈來源及形成機制將為心臟損傷后血管的修復與再生提供新的策略或方法。

目前，關于側支動脈新生有兩種解釋模型。一種是動脈發生（Arteriogenesis），即預先存在的動脈通過快速的管腔開放和血管壁增厚產生側支動脈（Helisch A et al.，Microcirculation 2003）；另一種是動脈化（Arterialization），即毛細血管通過血管生成進行血管重塑，并招募周細胞和平滑肌細胞，以產生側支動脈（Faber JE et al.，Arterioscler Thromb Vasc Biol 2014）。鑒于在成體心肌梗死過程中很少觀察到毛細血管通過動脈化產生冠狀動脈（He et al.，Cardiovasc Res 2016），目前的主流觀點更偏向于用動脈發生模型解釋新生的冠狀動脈。然而，隨著技術的發展，冠狀動脈新生的方式仍需進一步研究。

為靈敏且干凈地檢測到從毛細血管衍生出的動脈，研究人員在雙同源重組酶介導的譜系示蹤技術（He et al., Nature Medicine 2017）的基礎上，建立了無縫隙捕捉毛細血管動脈化的新系統。前人的研究之所以很難在成體捕捉到毛細血管動脈化的過程，有以下兩層阻礙。首先，毛細血管的分子標志物Apln在成體心臟中只活躍于部分血管新生的毛細血管而非動脈內皮細胞，這就使得在成體心臟中高效地標記毛細血管內皮細胞成為一個技術難題。其次，若單純標記毛細血管，想要在無數的毛細血管中找出由毛細血管動脈化產生的少量動脈無異于大海撈針，這種低分辨率的方法很容易讓研究者忽視掉由毛細血管動脈化產生的動脈。為克服以上阻礙，周斌團隊利用Cdh5-DreER、Apln-CrexER和Cx40-LSL-GFP三個小鼠品系，建立了一個在小鼠心臟中只標記由毛細血管衍生而來的動脈的系統。Cdh5-DreER是內皮特異性的小鼠品系，Apln-CrexER是毛細血管特異性的小鼠品系，Cx40-LSL-GFP可將動脈標記成綠色。當受到他莫昔芬的誘導后，Cdh5-DreER的DreER便會入核，切掉Apln-CrexER的rox-ER-rox，使得Apln-CrexER變成持續表達的Apln-Cre，而一旦表達Apln的細胞中的Cx40基因啟動，那么Apln-Cre的Cre就會入核，切掉Cx40-LSL-GFP的loxP-stop-loxP，使得該細胞呈亮綠色，也就是表達過Apln的毛細血管衍變成動脈（表達Cx40）后就會被綠色標記。該系統通過將Apln-CrexER變成Apln-Cre，突破了Apln-CreER只能在成體心臟中標記新生毛細血管的限制，同時通過Cdh5-DreER保留了用他莫昔芬作為誘導事件發生的優勢。此外，研究人員引入Cx40-LSL-GFP作為報告基因，將熒光標記限制在表達Cx40的動脈中，做到了只看毛細血管衍生的動脈，克服了標記所有毛細血管的缺陷。利用這套靈敏且清晰的系統，研究人員期望在心臟損傷過程中記錄所有毛細血管動脈化產生動脈的事件。

為了檢測該系統是否符合預期，研究人員基于新生期仍發生毛細血管動脈化的既有知識，對新生的Cdh5-DreER、Apln-CrexER、Cx40-LSL-GFP三基因型小鼠開展實驗。研究人員對p0天的三基因小鼠注射他莫昔芬，在p2天對該小鼠進行心肌缺血（MI）手術，p6天收取該小鼠的心臟進行分析。全組織熒光照片的結果表明，MI后形成了清晰的GFP+側支動脈，MI組的動脈數量較未損傷組要多，且通過免疫熒光染色共染平滑肌的標志物aSMA與GFP，證實GFP陽性的細胞都被aSMA包裹，表明毛細血管動脈化形成了側支動脈。以上結果既表明該系統可用于追蹤毛細血管動脈化產生的新動脈，也揭示了在新生期心臟損傷修復過程中的毛細血管內皮細胞貢獻給側支動脈的重要生物學過程。

為了在成體損傷情況下探究毛細血管動脈化產生動脈的情況，研究人員對8周大的Cdh5-DreER、Apln-CrexER、Cx40-LSL-GFP三基因型小鼠進行他莫昔芬注射，為避免他莫昔芬殘留對實驗結果的影響，研究人員在他莫昔芬注射后兩周才對小鼠進行心梗手術。為探究不同心梗類型下毛細血管的動脈化，研究人員引入了三種心梗模型，包括主動脈弓縮窄手術（TAC）、心肌缺血再灌注（MI/R）和心肌缺血（MI）。全組織熒光照片的結果顯示，在TAC和MI/R心梗模型下幾乎看不到GFP陽性的信號，而MI后可看到明顯的GFP陽性的血管形態。為了更加精細地探究該GFP陽性的細胞是否是動脈內皮細胞，研究人員對三種心梗模型中收到的心臟組織分別進行切片染色，利用免疫熒光染色的實驗技術，將GFP與aSMA、SM22、SM-MHC三種平滑肌細胞的標志物共染。結果表明，MI后出現的GFP陽性的細胞確實被aSMA、SM22、SM-MHC陽性的平滑肌細胞包裹，證實該由毛細血管衍生而來的GFP陽性的細胞是動脈內皮細胞。

此外，對在TAC和MI/R模型下得到的心臟樣本進行連續切片，均沒有檢測到GFP信號，為排除該系統在這兩種模型下效率較低的可能，研究人員引入了R26-LSL-tdTomato的小鼠，對Cdh5-DreER、Apln-CrexER、Cx40-LSL-GFP、R26-LSL-tdTomato進行TAC或者MI/R，收取其心臟樣本進行切片染色，發現大量的tdTomato信號，該結果表明，在TAC和MI/R模型下，Cdh5-DreER可以高效率切除Apln-CrexER的rox-ER-rox，使得Apln-Cre得以進一步切除R26-LSL-tdTomato的loxP-stop-loxP，從而將毛細血管內皮細胞標記成tdTomato。因此，研究人員推斷，TAC或者MI/R心梗模型下沒有檢測到GFP陽性的動脈內皮細胞，不是由于系統效率的原因，而是在這兩種損傷模型下，心臟的缺血程度不足以刺激毛細血管動脈化的發生。換言之，在嚴重的MI心梗模型下，存在毛細血管動脈化產生新的冠狀動脈。

綜上所述，該團隊基于實驗室建立的雙同源重組酶介導的譜系示蹤技術，開發出一套更加靈敏且清晰的系統，實現了在成體損傷條件下追蹤毛細血管動脈化產生動脈的目標。這項研究結果豐富了成體損傷條件下新生動脈來源的知識，為心臟損傷后血管修復與再生治療提供了新思路。

（中國科學院分子細胞科學卓越創新中心）