ApoB100 對肝臟VLDL合成分泌的影響及其在獸醫臨床中的研究進展

范文文，王 爽，高暢鴻，田 艷，鄒存志，徐 闖，張冰冰，楊 威

（1. 黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江大慶 163319 ；2. 黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，黑龍江大慶 163319）

脂肪肝（fatty liver）是泌乳早期奶牛的主要代謝疾病，與健康狀況和繁殖性能下降有關。奶牛脂肪肝由多種因素引起，肝臟內脂質過量蓄積是脂肪肝發病的主要因素[1]。奶牛患脂肪肝后，肝臟中蓄積大量脂肪，可導致肝臟合成能力減弱，從而使肝臟免疫應答有關的復合物能力降低，造成肝臟代謝化合物、代謝產物以及代謝激素發生改變，也會導致免疫功能減弱，影響繁殖性能及泌乳能力。因此，預防脂肪肝發生并有效治療可降低奶農的損失。

肝臟是脂肪代謝的中心器官，通過分泌極低密度脂蛋白（VLDL）運輸內源性合成的甘油三酯（TG），還可將一部分膽固醇和膽固醇酯輸送至外周組織。奶牛患脂肪肝后，除血液中非酯化脂肪酸（NEFA）濃度升高外，還會引起VLDL 濃度升高[2]。VLDL 分泌紊亂時會引起TG 積累，導致疾病發展。載脂蛋白B100（ApoB100）作為VLDL 的主要蛋白質成分，能夠調控VLDL 的合成和分泌速率，為組裝和分泌富含TG顆粒所必需。肝臟VLDL的組裝一直是深入研究的主題之一，ApoB100 作為肝臟合成分泌VLDL必不可少的載脂蛋白，也一直是研究奶牛脂肪肝發病機制的熱點。

1 VLDL的合成與分泌

1.1 VLDL的原料組成

VLDL 是由肝臟利用乳糜微粒殘粒、膽汁酸、脂肪酸、糖和蛋白質的中間代謝物與肝臟內合成的載脂蛋白共同組成的一種脂蛋白[3]，大小約為30～80 nm，含有TG、膽固醇、膽固醇酯和磷脂，其中TG為主要成分，含量約占60%。VLDL蛋白質部分包括ApoB100、ApoA1、ApoC、ApoE等，其中ApoB100是VLDL的核心結構蛋白，每個VLDL顆粒包含一個ApoB100分子[4]。

1.2 VLDL的生物學功能

肝細胞在系統性脂質穩態中的一個主要功能是內化循環脂質。對脂酸進行加工，并將細胞代謝不需要的脂肪酸融入TG、膽固醇酯和膜酯，之后作為VLDL釋放至血液中[5]，此過程主要依賴TG的可用性，用于組裝VLDL的TG在內質網腔中合成，以預防游離脂肪酸流入。

向肝臟提供的游離脂肪酸主要有3 種來源，即脂肪細胞的游離脂肪酸、乳糜微粒殘留物以及腸道經門靜脈[6]。無論是血液運輸到肝細胞的脂肪酸，還是糖代謝轉變形成的脂肪酸，在肝細胞中均可合成TG。在肝細胞內，TG 與ApoB100、膽固醇等結合，形成VLDL并釋放入血。VLDL從肝臟向周圍組織輸出脂質，是低密度脂蛋白（LDL）的前體，主要負責將肝臟中合成的內源性TG運輸到周圍組織，提供了能量來源[7]。

1.3 VLDL的組裝和分泌

VLDL 的生物合成及其由肝臟分泌到循環系統中是1 個復雜且受到高度調控的過程，在整體脂質穩態中起到重要作用[3]。VLDL 的生物合成發生在內質網腔內，分為兩步完成：第一步是新翻譯的ApoB100通過粗糙的內質網膜進行易位，一部分新生的ApoB100 被脂化，形成了1 個缺乏脂質的原始VLDL粒子。微粒體TG轉移蛋白（MTP）能夠將中性和極性脂質轉移至發展中的VLDL粒子，促進了VLDL 的生物合成[8-9]。除MTTP 外，酵母Hsp110 可防止ApoB 的降解。Hrizo 等[10]將Hsp110 在哺乳動物細胞中過表達，結果發現，Hsp110、Sse1p 可能有助于Hsp70 或Hsp90 依賴性ApoB 的共翻譯降解，表明ApoB 可看作是Hsp110的作用位點。

第二步是原始VLDL 顆粒從定位于內質網腔的脂滴中接收脂質，脂質通過脂質融合或腔內TG水解，之后酯化轉移至高爾基體，發生進一步膨脹[5]。有研究提出，Cideb（細胞死亡誘導DFF45 樣效應物的同源物）蛋白也在含有ApoB100 的脂質化不良原始VLDL 顆粒的脂質化中起到了一定作用；小鼠試驗表明，Cideb通過與ApoB100相互作用，并將脂滴中的TG 轉移至更高密度的VLDL 前體，在VLDL脂化和成熟中起重要作用[11]。

2 ApoB100對肝臟VLDL合成分泌調控特征

2.1 ApoB100的結構和功能

載脂蛋白B（ApoB）是一種存在于血漿脂蛋白中的大型兩性親糖性蛋白，分子量約為515 kDa，屬于載脂蛋白。根據氨基酸組成不同，可將ApoB 分為兩種亞型，分別為ApoB48 和ApoB100[12]。ApoB48 是哺乳動物腸道內主要的亞型，通過產生終止密碼子Apobec-1 介導的位點特異性mRNA編輯合成[13]，存在于乳糜微粒及其殘余物中。在人類及哺乳動物肝臟中，ApoB100 為主要成分，存在于VLDL、中密度脂蛋白（IDL）和LDL 上，并在肝臟中表達。而在大鼠和小鼠體內，上述兩種亞型均在肝臟內合成，可以組裝成VLDL[14]。

ApoB100是完全翻譯的蛋白質，具有廣泛的疏水性斑塊和多個分子內二硫鍵。ApoB100 折疊并組裝成新生的VLDL 前體顆粒需要在內質網中進行處理，在高爾基體中發生更多的VLDL 前體成熟，以達到分泌能力狀態[15]。ApoB100作為肝臟合成分泌VLDL必不可少的載脂蛋白，是低密度脂蛋白受體（LDLR）介導的LDL顆粒內吞作用的配體，也是血漿中乳糜微粒和LDL 主要的組成蛋白，主要通過肝臟表面的LDLR 介導細胞內吞作用清除脂質代謝的殘余物[4]。

ApoB100組裝成VLDL 大致可分為兩個步驟：翻譯過程中，通過MTP 將脂質轉移至ApoB100 以及載脂蛋白前體粒子與TG液滴融合形成成熟的VLDL。磷脂酶可能啟動第二步融合所需的膜運輸步驟，引導磷脂進入VLDLTG生產途徑，VLDL生產主要控制在分泌前降解水平[16]。

2.2 ApoB100影響VLDL合成分泌機制

VLDL和乳糜微粒的合成與分泌受到脂質和蛋白質的影響。食物經過胃及小腸被消化后，進入小腸的膽固醇以乳糜微粒的形式進入血液中，在肝臟中與ApoB 轉化為富含TG 的VLDL，其中的TG 被水解，轉化為富含膽固醇的LDL。LDL 中的ApoB 能夠特異識別LDLR 并與之結合，經胞內吞飲作用送至溶酶體中降解，從而清除循環中大部分的LDL。若編碼ApoB 的遺傳物質發生變化，可引起ApoB結構改變，無法識別LDLR，進而引發其水平升高，還可引起脂質代謝紊亂。

ApoB100是VLDL 組裝和分泌所必需的蛋白質，且每個VLDL均具有一個相應的ApoB100分子，使ApoB100的可用性成為決定VLDL粒子數量的關鍵因素，進而決定了肝細胞分泌的TG[17]。但與大多數肝臟分泌蛋白的合成不同，肝臟中的ApoB100通常并非由其相對恒定的合成水平調控，而是由共降解和翻譯后降解調節，此現象首次在人類HepG2 細胞和大鼠原代肝細胞中觀察到。研究表明，ApoB100在細胞內發生降解，在原代肝細胞中降解不太明顯，但在一些肝癌細胞系（如典型的HepG2 細胞）中，幾乎80%新合成的ApoB100可通過此類降解去除[18]。

2.3 ApoB100在肝臟中的降解

與許多其他分泌的肝臟蛋白質相比，ApoB100的分泌主要由共降解和翻譯后降解調節。此過程發生在VLDL組裝和成熟期間。ApoB100 的產生主要受細胞內降解的調節，蛋白酶體途徑是降解的主要機制。ApoB100的產生受到多種降解途徑的影響，目前已報道的ApoB 降解位點有3個：

（1）由蛋白酶體介導的內質網關聯降解（ERAD)。ERAD 作為分泌途徑中的蛋白經典途徑，至少包括3 個步驟，分別是底物識別、從內質網轉位到胞質和泛素化以及在蛋白酶體中降解。上述步驟需要腔內伴侶、完整膜蛋白、胞質伴侶和蛋白酶體間的合作，其中一些ERAD 成分參與了ApoB100 的蛋白酶體降解。細胞脂質缺乏或脂質轉移時，ERAD 途徑最活躍。在此情況下，脂蛋白組裝所需的新合成ApoB100較少，而相對過量的ApoB100會被蛋白酶體降解[19-20]。

在限制脂質供應的條件下，如微粒體TG 轉運蛋白活性或脂質可用性降低，導致ApoB100在內質網上轉位至泛素-蛋白酶體系統的過程中未能脂化，此過程稱為內質網關聯降解。Fisher 等[19]研究發現，減少ApoB100 的泛素化可增強VLDL的組裝，而改善ApoB100的脂化則會降低其泛素化，表明ApoB100 對VLDL 組裝過程具有調節作用，且ERAD是ApoB100組裝成VLDL的關鍵降解位點。

（2）新合成的ApoB100 在到達細胞表面時，遇到LDLR 或硫酸肝素蛋白聚糖被內化，并進行溶酶體降解的再攝取途徑。sortilin 作為參與高爾基體到溶酶體運輸的多配體分選受體，與ApoB100 具有高親和力，在高濃度條件下可能會引導ApoB100，促進溶酶體降解[21]。LDLR 在調節含有ApoB100的脂蛋白分泌方面具有重要作用；有研究表明，LDLR 不僅與細胞表面的ApoB100 相互作用，在分泌途徑的早期與ApoB100 也會發生相互作用[22]。上述相互作用對ApoB100的翻譯后降解具有重要意義。

Twisk 等[23]探究了野生型和LDLR缺陷小鼠肝細胞中LDLR的存在與脂蛋白分泌之間的關系，研究表明，LDLR的缺失對ApoB100的再攝取途徑存在不同程度的影響。

（3）后內質網分泌前蛋白水解過程（PERPP）是指ApoB100 在離開內質網后受調控的降解。PERPP 是一種非蛋白酶體途徑，由體外和體內多種代謝因子引起，包括細胞內脂質過氧化，如sortilin 介導的ApoB 降解[14]。sortilin 1 是miR-378a-3p 直接作用的靶點。Zhang 等[24]研究發現，在高脂血癥的狀態下，miR-378a-3p 在肝臟內通過抑制sortilin 1 作為跨膜運輸受體的功能進行特異性表達，能夠促進VLDL的肝臟分泌，提高了VLDL或LDL、膽固醇以及TG的水平。

PERPP 是在肝臟來源的細胞內降解新合成ApoB100的新途徑，通過翻譯后降解調節，減少了肝臟細胞的脂蛋白分泌。該途徑通過飲食多不飽和脂肪酸，在肝細胞內產生活性氧而增加。通過PERPP 控制ApoB100 分泌，是血漿中ApoB 水平正常和病理調節的關鍵組成部分，也是一種顯著的分泌蛋白后期質量控制手段[25]。

ApoB100 的降解是肝細胞可分泌VLDL 顆粒數量的主要決定因素，也是肝臟凈TG 產生的調節因子。完成ApoB100降解的方式較多，可表明ApoB100在VLDL組裝和分泌中的重要性以及肝細胞對各種代謝狀態和應激作出反應的靈活性。ApoB100 降解速率的變化是各種代謝擾動后，含ApoB100和ApoB100脂蛋白肝臟分泌差異的潛在解釋，確定每種已知的ApoB100降解途徑對其體外凈分泌調控的定量影響非常重要。通常情況下，每個途徑的作用均孤立于其他途徑。

2.4 ApoB100在肝臟中的自噬作用

自噬是介導ApoB100 降解的一種誘導形式。自噬在參與維持脂質穩態的主要器官肝臟和脂肪組織中調節脂質儲存，在調節肝臟脂質穩態和VLDL分泌中發揮多種作用。肝細胞中，自噬作用的關鍵是胞質脂滴的分解，此過程被稱為脂噬；與之相反，脂肪細胞分化和脂滴的同時積累需要自噬。

自噬還可通過促進脂蛋白組裝影響脂質代謝。目前已有許多研究表明，ApoB100 的降解過程中存在自噬現象；如對大鼠肝癌細胞的研究發現，通過敲低ATG7表達或使用3-MA 過表達抑制自噬體組裝，可緩解細胞內ApoB100 的 降解[26]；Sun 等[27]通 過過 表達PCSK9，表 明PCSK9 與ApoB 相互作用，通過影響自噬抑制ApoB 的降解途徑，進而調節ApoB的分泌。

異常自噬可能與代謝紊亂（如代謝綜合征）中脂質穩態失調有關。胰島素信號和自噬活性在相互調節機制中出現分歧，提示自噬在胰島素抵抗中發揮作用；上調自噬可能導致白色脂肪組織向棕色脂肪組織轉化，從而調節能量消耗和肥胖。此外，上調肝細胞自噬可增加脂質儲存的破壞，控制TG穩態和脂肪肝[28]。

自噬或PERPP 可視為1 種通過破壞ApoB100 從而調節其水平的控制途徑，以避免肝細胞出現ApoB100 和VLDL 顆粒積累；若顆粒太大而無法由內質網相關降解途徑處理，需要從內質網逆向易位并由蛋白酶體降解。因此，增加自噬是一種保護性的、穩態的反應。由此可見，自噬在脂質穩態中發揮非常復雜的作用，根據不同組織影響脂質儲存并參與脂蛋白的代謝途徑[29]。

3 ApoB100在獸醫臨床中的相關研究

ApoB100的合成分泌受到代謝影響，自然發生和乙硫氨酸誘發的脂肪肝血清中ApoB100濃度降低。因此，脂肪肝是奶牛血清ApoB水平降低的主要原因。ApoB100受體結合區的基因結構及其突變情況可為揭示圍產期奶牛脂肪肝和酮病的發病機制提供參考，同時為奶牛脂肪肝的基因治療提供參考。

ApoB100作為VLDL 的結構蛋白和主要的載脂蛋白，其主要功能是參與VLDL和LDL的組裝和分泌，而預防或治療脂肪肝的方法之一是增加VLDL 從肝臟輸出的速率[30]。ApoB100 的降解是肝細胞可分泌VLDL 顆粒數量的主要決定因素。隨著越來越多小鼠模型建立，上述降解通路通過基因操作而減弱或過度活躍，在體內測試其對肝臟ApoB100 產生的影響將是細胞培養研究和治療奶牛脂肪肝的重要聯系。Zhou等[31]采用油酸誘導肝細胞、果糖誘導小鼠肝脂肪變性，結果發現，GF-Ala 能夠顯著抑制ApoB100 的翻譯后降解，改善肝臟脂質積累，減少脂質過氧化，促進肝細胞TG 轉運。研究表明，GF-Ala 可能是治療脂肪肝的潛在藥物。

4 結論

肝臟VLDL 的組裝一直是深入研究的主題。20 世紀80年代中期，已有對ApoB100通過降解調控VLDL的相關研究，但主要集中于原代大鼠肝細胞和人HepG2細胞中新合成的ApoB100的周轉率。隨著研究深入，越來越多的研究表明，ApoB100通過多個降解途徑以及自噬等方式影響VLDL的合成分泌。

ApoB100作為VLDL 顆粒中的主要和必需蛋白質，對VLDL 顆粒的組裝和分泌發揮重要作用。因此，后續的深入研究對臨床上相關疾病的治療可起到關鍵作用。