牛病毒性腹瀉-黏膜病的研究進展

張國華，呂思文，金振華，王麗坤，張 備，薛沾枚，張 艷，黃新育

（1. 黑龍江省農業科學院畜牧獸醫分院，黑龍江齊齊哈爾 161005 ；2. 齊齊哈爾市龍沙區農業綜合行政執法大隊，黑龍江齊齊哈爾 161000）

牛病毒性腹瀉-黏膜病（BVD-MD）主要特征為發熱、咳嗽、黏膜病變、消化道線性病變、白細胞減少、免疫抑制、持續感染等[1]；妊娠母牛感染該病還可能導致胎兒畸形、產死胎或流產等。BVD-MD 可引起免疫抑制及持續感染，導致防控難度相對較大[2]。BVD-MD呈世界性分布，尤其在畜牧業發達的國家分布更廣泛。20 世紀80 年代，我國首次報道了BVD-MD的感染情況，截至目前，我國多個地區已有該病的相關報道，嚴重危害我國養牛業[3]。本文簡述了BVD-MD 的生物學特征、國內外流行情況、臨床類型、診斷方式以及該病的防治方法，為BVD-MD的進一步研究提供一定參考。

1 BVD-MD的生物學特征

BVD-MD 由牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）引起[4]。BVDV 與豬瘟病毒（CSFV）、綿羊邊界病毒（BDV）同屬黃病毒科、瘟病毒屬[5]。BVDV具有包膜，為單股RNA病毒，分子大小約為12.4 kb，編碼的序列主要可分為3 部分：5'UTR、OFR 以及3'UTR[6]。5'UTR 長度約為380 bp，根據此序列可將BVDV 進行基因分型，可分為BVDV1 型和BVDV2 型，其中BVDV1 型已被分為22 個基因亞型（1a～1v），BVDV2 型分為4 個基因亞型（4a～1d）[7]。OFR 區編碼4個結構蛋白和7個非結構蛋白。3'UTR的長度約為230 bp 左右，其中包括對病毒復制具有重要作用的原件，具有較高的保守性。

BVDV 結構近似球形，沉淀系數約80～90 S，直徑約40～60 nm[8]。BVDV對胰酶、乙醚、氯仿等有機溶劑具有相對較高的敏感性，酸性環境下極易失去活性，在堿性環境下具有一定的耐受能力[9]。BVDV 對于溫度敏感性高，在56 ℃環境下，30 min 即可失去活性。分離或者傳代的BVDV 在體外培養的難度不高，可在多種細胞中存活，目前應用于大多數實驗室利用牛腎細胞（MDBK）進行的病毒增殖。根據細胞接種BVDV病毒后是否會導致病變，又可分為CP 型和NCP 型兩種類型；一般情況下，CP 型與病毒的致病性無關，自然環境中NCP型的數量大于CP型，當感染NCP 型病毒時可引起細胞發生核固縮、產生空泡、細胞溶解、死亡等[10]。

2 國內外BVD-MD的流行情況

20 世紀60 年代，美國首次報道BVD-MD，之后加拿大、秘魯、法國、羅馬尼亞、英格蘭、澳大利亞也陸續發現該病。20世紀90年代，一項血清學檢測的調查結果顯示，北美BVD-MD 的陽性率50%～80%，秘魯50%～90%，法國76%～95%，羅馬尼亞64%～90%，英格蘭62%～85%，澳大利亞89%～95%[11]。其中北美國家以BVDV1a和BVDV1b、2a型等基因型較為常見[12]，歐洲國家以BVDV1b 型較常見，大洋洲則以BVDV1c型較常見[13]。

20 世紀80 年代，我國分離到第一例BVDV，之后我國的多個省市自治區均有BVD-MD 的相關報道，逐漸引起了人們對BVDV-MD 的重視。2013 年，李棟梁等[14]對北京地區的BVD-MD 的發病情況進行了調查，結果顯示，BVD-MD 高風險牛場為12 個。2015 年，譚春萍等[15]對廣西部分地區牛病毒性腹瀉病毒流行情況進行了調查，結果顯示感染率為3.41%。2016 年，曲萍等[16]對西北地區BVD-MD流行情況進行調查，結果顯示，所調查區域內群陽性率為84.38%,個體陽性率為61.88%。2017 年，Deng等[17]對我國19 個省的92 個奶牛場進行了BVD-MD 流行情況的調查，并對5'UTR進行測序，發現存在8種不同亞基因型的BVDV-1，包括1a、1b、1c、1d、1m、1q以及暫定為未知亞基因型“BVDV-1v”和“BVDV-1w”。

2019年，郭啟勇等[18]等對寧夏地區的BVDV流行情況進行檢查，結果發現，抗原陽性率達到2.71%，且抗體陽性率已超過85%。2021年，王晨豫等[19]對新疆部分規模奶牛場采集血清和耳組織樣本，并進行BVDV 抗原檢測，結果顯示，血清抗原陽性率1.21%，耳組織檢測陽性率1.17%。我國許多省份均有BVDV感染的情況，需要采取足夠的重視以及相應措施，改善目前的情況。

3 BVD-MD的臨床類型

3.1 持續感染

持續感染（PI）是BVD-MD 發生后出現的獨特臨床類型。NCP型BVDV可有效逃避宿主的免疫應答而發生PI，即妊娠母牛若在妊娠早期感染該病毒，由于胎兒早期免疫系統尚未發育完全，無法識別NCP型BVDV并產生有效的免疫應答[20]，導致與健康牛相比，PI 牛發育遲緩且攜帶病毒；若PI 牛排出病毒將引起其他牛感染。一般情況下，PI牛在6月齡至2歲因感染黏膜病（MD）而死，未死亡的成年PI 牛繁殖的后代將一直攜帶BVDV[21]。因此，為控制BVD-MD傳播，養殖場應做好PI牛的凈化工作。

3.2 免疫抑制

免疫抑制會在一定程度上損害機體的免疫能力，降低機體對其他疾病的抵抗能力。BVDV 引起宿主動物發生免疫抑制，主要通過改變免疫細胞功能、降低反應能力、影響免疫細胞在機體內的分布，進而導致機體免疫功能下降，增加了其他病菌侵入機體的情況，引起繼發感染[22]。

3.3 MD

MD是BVDV發生感染而引起的一種最嚴重的臨床類型，發病率、病死率高，犢牛以及亞成牛表現為腹瀉、脫水等癥狀。NCP 型BVDV 與CP型BVDV 的變化導致了MD較高的致死率。感染NCP 型BVDV 的妊娠母牛可產出PI犢牛，PI 犢牛會對自身攜帶的NCP 型BVDV 產生免疫耐受，但再次感染到相同來源的CP 型BVDV 即可引起MD[23]；若感染不同來源的CP型BVDV將刺激動物的機體產生相應的抗體抵制新入侵的病毒。因此，在部分PI動物體內可檢測到BVDV抗體。

4 BVD-MD的診斷方式

4.1 病毒分離鑒定

病毒分離是病毒診斷的重要標準。當動物疑似感染BVDV 時，將患病動物的組織器官進行相應的處理，接種于MDBK 中，經過3～5 代盲傳后觀察是否出現病變，收集病毒。該方法是BVDV診斷的金標準，但由于細胞培養存在難度要求高、試驗周期長等缺點，故在診斷中應用較少。

4.2 RT-PCR法

BVDV分為2個基因型，具有高度保守的5'UTR區域，以該區域為目的片段設計引物，運用RT-PCR法可以很好地對BVD 進行診斷。2017 年，王吉等[24]設計的BVDV RT-PCR 檢測方法具有檢測速度快、特異性高、敏感性好等優點，檢測BVDV1 型和BVDV2 型DNA 模板濃度低至8.87×102和6.31×102copies/μL。2018 年，李佳暖等[25]建立的BVD 高效納米PCR 檢測方法具有更優秀的敏感性，其最小檢出BVDV量為15.2×10-4mg/L。

4.3 熒光定量PCR法

目前，熒光定量PCR 法主要包括SYBR GREEN 法和TapMan探針法，與PCR法相比，具有更好的特異性及靈敏度。2018 年，王艷杰等[26]建立了雙重TapMan 探針法檢測BVDV，Ⅰ型BVDV 檢 測 下 限 為10.0 copies/μL，Ⅱ型BVDV檢測下限為100 copies/μL。2019年，任亞初等[27]建立SYBR GREEN 法檢測BVDV，檢測下限為4.87×10 copies/μL。2021 年，張康等[28]建立了TapMan 探針法檢測BVDV，檢測下限為5.0 copies/μL。熒光定量PCR 法檢測BVDV 具有很多優點，對BVD 的早期診斷具有極高的臨床意義。

4.4 ELISA法

ELISA法非常適合大量的BVDV血清樣本的檢測，且目前技術已經相對成熟。2016 年，常敬偉等[29]建立的BVDV 抗體間接ELISA 方法通過表達E2 蛋白，包被純化的蛋白；結果顯示，與愛德士間接ELISA BVDV 試劑盒相比，此檢測方法的符合率為91.5%，與其他呼吸道綜合征候群的疾病無交叉反應，可進行大批量樣本的抗體監測以及流行病學調查。

4.5 間接免疫熒光

PCR法、熒光定量PCR法等方法主要檢測基因水平的物質，無法確定病毒的感染性。2017 年，黃杰等[30]建立了BVDV間接免疫熒光檢測法，以山羊抗牛BVDV抗體作為一抗，熒光素FITC標記的兔抗羊免疫球蛋白G（IgG）作為二抗，可以更好地檢測BVDV病毒顆粒。上述間接免疫熒光檢測法可檢測疫苗中是否存在BVDV污染，并且可應用于BVDV的定位以及感染情況的研究。

4.6 RT-LAMP法

RT-LAMP 即逆轉錄和環介導等溫擴增（loopmediated isothermal amplification）的結合，可應用于快速擴增RNA。此技術的特異性、靈敏度、檢測范圍優于RTPCR 法，同時還具有操作簡單、無須專業設備的優點。2022 年，張宇名等[31]建立了可視化一步RT-LAMP 檢測BVDV的方法，參照GENBANK上BVDV的5'UTR數據設計了兩組引物，結果顯示，最低檢測下限為0.021 ng/L，且檢測結果與商品化ELISA試劑盒相比，符合率為100%，具有良好的特異性、靈敏性，適用于臨床診斷。

5 BVD-MD的預防與治療

BVD-MD 存在較廣泛，致病機制復雜，歐美國家防控BVD-MD 的主要措施為撲殺PI 動物、疫苗接種及加強監測。我國目前對該病的防治主要為注射疫苗，但也有部分地區尚未實行凈化。

5.1 預防

目前對BVD-MD等傳染性疾病仍采取預防為主的方針，在發生疾病前即采取良好的預防措施，保證養殖戶、養殖場能夠更安全地進行生產活動[30]。應重視BVD-MD疫苗注射，保證疫苗的質量以及正確的使用方法，達到最佳的預防效果，并定期進行BVDV 抗體監測。為切斷傳染源，應對PI牛進行抗體檢測，首次檢測后對PI牛進行隔離，21 d后若仍檢測為陽性即進行淘汰。加強飼養管理，保證飼料營養均衡；飼養環境干燥且具有較好的通風性，提高動物的抵抗力，更好地防控BVD-MD[32]。

5.2 治療

目前尚無針對BVD-MD 的特效藥，故治療BVD-MD仍主要在日常飼養管理、疾病預防等方面加強牛的抵抗力。若發生了BVD-MD 疫情，需要迅速隔離患病牛并進行徹底的消毒，患病牛進行對癥治療、補充體液，降低由于抵抗力下降而繼發感染其他疾病的風險[33]。圈舍以及飼養用具采用漂白粉進行消毒，出現口腔潰瘍癥狀的患病牛采用高錳酸鉀進行消毒處理。此外，也可結合中醫療法對患病牛進行治療[34]。

6 結論

BVDV結構復雜，基因具有多個亞型，變異性大，防控難度大。隨著我國畜牧業不斷發展，牛的進出口愈發頻繁，促進了我國養牛業發展，但同時也對BVD-MD的檢測和預防產生了更大的挑戰。應加強飼養管理及防疫，以科學的方法進行臨床診斷，預防BVD-MD發生。