IFN-γ、IL-2聯(lián)合檢測(cè)在結(jié)核病中的診斷價(jià)值

廖家吉 楊曉輝 蒲渝成 青建植

結(jié)核病是全世界人類(lèi)最常見(jiàn)的細(xì)菌感染之一，由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染造成，但絕大多數(shù)MTB感染者無(wú)臨床癥狀。近年來(lái)，隨著MTB耐藥菌的出現(xiàn)，全世界范圍內(nèi)結(jié)核病的感染和傳播水平不斷升高。世衛(wèi)組織統(tǒng)計(jì)資料表明，全世界三分之一以上的人曾感染過(guò)MTB，其中10%發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病者，每年因其死亡人數(shù)高達(dá)300萬(wàn)以上[1]。而我國(guó)作為結(jié)核病流行重災(zāi)區(qū)，對(duì)結(jié)核病的早期診斷和預(yù)防必須十分重視[2]。由于影像學(xué)檢查缺乏特異性，因此臨床上診斷結(jié)核病主要依靠病原學(xué)檢測(cè)，但MTB分離培養(yǎng)和抗酸桿菌涂片法的診斷陽(yáng)性率偏低，且對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核診斷敏感性不足[3]。因此，急需一種快速、簡(jiǎn)便且準(zhǔn)確的新診斷方法。在機(jī)體受到MTB感染時(shí)，主要依靠激活CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能來(lái)清除，而分泌干擾素-γ（IFN-γ）和白介素-2（IL-2）細(xì)胞因子的CD4+T細(xì)胞與抗結(jié)核感染緊密相關(guān)[4]。因此，本研究通過(guò)分析結(jié)核病患者IFN-γ和IL-2的表達(dá)水平，并探討IFN-γ、IL-2及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)結(jié)核病的診斷效能，為臨床輔助診斷結(jié)核病提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021年5-7月廣西壯族自治區(qū)胸科醫(yī)院收治的462例疑似結(jié)核病患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥15歲；均接受結(jié)核病臨床癥狀、體征、胸部影像學(xué)、細(xì)菌學(xué)檢測(cè)和組織病理學(xué)檢查；確認(rèn)結(jié)核病患者均接受常規(guī)治療并進(jìn)行抗結(jié)核療效評(píng)估；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：具有自身免疫性疾病或免疫缺陷病毒感染；妊娠、接受長(zhǎng)期免疫抑制劑治療；合并惡性腫瘤及嚴(yán)重肝、腎器官功能不全嚴(yán)重疾病。男283例，女179例；年齡15～92歲，平均（56.27±16.13）歲。按照2018年最新實(shí)施的肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS 288-2017），其中確診結(jié)核病232例，納入結(jié)核組，非結(jié)核病230例納入組非結(jié)核組。232例結(jié)核病中繼發(fā)性肺結(jié)核179例，肺外結(jié)核53例（含結(jié)核性胸膜炎25例，結(jié)核性關(guān)節(jié)炎13例，結(jié)核性腹膜炎7例，結(jié)核性腦膜炎5例及頸部淋巴結(jié)核3例）。結(jié)核組年齡15～88歲，非結(jié)核組年齡17～92歲。兩組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。本研究經(jīng)過(guò)本院倫理審查委員會(huì)審核批準(zhǔn)通過(guò)，患者自愿參與本研究并知情同意。

表1 兩組一般資料比較

1.2 方法

兩組均進(jìn)行結(jié)核特異性細(xì)胞因子IFN-γ和IL-2檢測(cè)。采集患者外周靜脈血（每份不少于4 ml）至含肝素抗凝劑采血管中，加入等體積RPMI-1640（天津?yàn)螅琑PMI1640LT，規(guī)格：500 ml/瓶）混勻后以（2～3）∶1加入淋巴細(xì)胞分離液（天津?yàn)螅琇TS1077，規(guī)格：200 ml/瓶）上層，室溫梯度離心后吸取單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）層至RPMI培養(yǎng)液，計(jì)數(shù)后根據(jù)數(shù)量稀釋至工作濃度，取50 μl無(wú)血清培養(yǎng)基至空白對(duì)照孔，50 μl結(jié)核特異性融合蛋白至檢測(cè)孔，50 μl陽(yáng)性刺激物至陽(yáng)性對(duì)照孔，之后加入配好濃度的細(xì)胞懸液，37 細(xì)胞培養(yǎng)箱（Biobase，QP-160）中培養(yǎng) 16～20 h。本研究采用結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫法）（DeFine.TB）[廣州迪澳醫(yī)療科技有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2014第3401353號(hào)，規(guī)格：28人份/盒]分別檢測(cè)IFN-γ及IL-2表達(dá)水平，顯色反應(yīng)使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀（深圳匯松，MB-580），試驗(yàn)操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。

1.3 觀察指標(biāo)

比較兩組結(jié)核特異性細(xì)胞因子IFN-γ和IL-2的表達(dá)水平。分析IFN-γ、IL-2及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)結(jié)核病的診斷效能。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析和處理，符合正態(tài)分布特征的計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。繪制受試者工作特征（ROC）曲線分析IFN-γ和IL-2及聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能，曲線下面積（AUC值）比較采用Z檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組結(jié)核特異性細(xì)胞因子IFN-γ和IL-2的表達(dá)水平比較

結(jié)核組IFN-γ和IL-2表達(dá)水平分別為（256.98±24.36）、（106.90±10.21）pg/ml；非結(jié)核組IFN-γ和IL-2表達(dá)水平分別為（15.96±1.98）、（8.13±1.67）pg/ml。結(jié)核組IFN-γ和IL-2表達(dá)水平均明顯高于非結(jié)核組（t=9.818、9.510，P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 兩組結(jié)核特異性細(xì)胞因子IFN-γ和IL-2的表達(dá)水平比較

2.2 IFN-γ、IL-2及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)結(jié)核病的診斷效能

繪制IFN-γ和IL-2及聯(lián)合檢測(cè)的ROC曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測(cè)AUC值明顯高于IFN-γ、IL-2單獨(dú)檢測(cè)的AUC值（Z=2.817、3.036，P＜0.05）。聯(lián)合檢測(cè)的Youden指數(shù)最高為0.750，敏感度和特異度分別高達(dá)89.3%和85.7%，見(jiàn)表2、圖2。

表2 IFN-γ、IL-2及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)結(jié)核病的診斷效能

圖2 IFN-γ、IL-2及聯(lián)合檢測(cè)診斷結(jié)核病的ROC曲線

3 討論

盡管經(jīng)過(guò)多年診斷技術(shù)的革新和發(fā)展，目前結(jié)核病的診斷仍然具有很大的挑戰(zhàn)性。MTB攜帶的蛋白和多糖抗原表達(dá)豐富，故針對(duì)結(jié)核病診斷的免疫學(xué)方法雖多但特異性較差，而常規(guī)結(jié)核病病原體陽(yáng)性培養(yǎng)和鑒定的敏感性較低，因此，臨床上對(duì)診斷結(jié)核病，特別是活動(dòng)性結(jié)核病提出了更高的需求。機(jī)體在被MTB感染后，會(huì)誘發(fā)巨噬細(xì)胞吞噬和消化MTB病原體，并將MTB抗原特異性片段遞呈T淋巴效應(yīng)細(xì)胞，刺激特異性CD4+T細(xì)胞迅速增殖和活化產(chǎn)生特異性淋巴因子包括IFN-γ、IL-2等激活巨噬細(xì)胞從而介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)[5]。同時(shí)，部分活化的CD4+T細(xì)胞在介導(dǎo)免疫反應(yīng)后分化為抗原特異性記憶T細(xì)胞，當(dāng)再次遇到MTB刺激時(shí)，抗原特異性記憶T細(xì)胞會(huì)迅速增殖為效應(yīng)T細(xì)胞發(fā)揮更高效的細(xì)胞免疫反應(yīng)[6]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)核組IFN-γ和IL-2表達(dá)水平均明顯高于非結(jié)核組（P＜0.05）。表明機(jī)體內(nèi)CD4+T淋巴細(xì)胞或抗原特異性記憶T細(xì)胞在MTB感染后，接受特異性抗原刺激產(chǎn)生了大量IFN-γ和IL-2細(xì)胞因子。

IFN-γ是主要的Th1型細(xì)胞效應(yīng)因子，具有廣泛的抗細(xì)菌和病毒及免疫調(diào)節(jié)的作用。既往研究表明，隨著細(xì)胞免疫應(yīng)答的啟動(dòng)，CD4+Th1細(xì)胞分泌IFN-γ與IL-2等細(xì)胞因子激活巨噬細(xì)胞，而在抗結(jié)核感染過(guò)程中IFN-γ是促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化的重要組成部分，被激活的巨噬細(xì)胞發(fā)揮強(qiáng)大的溶菌效應(yīng)以殺傷結(jié)核分枝桿菌，在結(jié)核病的控制中舉足輕重[7]。近年來(lái)，隨著免疫診斷技術(shù)的飛速進(jìn)步，開(kāi)發(fā)出了以MTB的特異性抗原（CFP-10和ESAT-6）為抗原肽刺激的T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT.TB）法，MTB分泌的兩種特異性抗原會(huì)刺激人體T淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ，從而通過(guò)檢測(cè)IFN-γ的釋放效應(yīng)來(lái)診斷結(jié)核病。在結(jié)核病診斷中取得了良好的效果，此方法因避免了患者因老年、免疫缺陷感染、自身免疫病及其他病原體感染帶來(lái)的影響，在結(jié)核病的診斷中擁有較高的敏感性和特異性[8]。但有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，在活動(dòng)性肺結(jié)核治療期間觀察到患者T細(xì)胞體外應(yīng)答下降，造成MTB分泌的特異性抗原（CFP-10和ESAT-6）刺激人體T細(xì)胞分泌IFN-γ的能力減弱，從而導(dǎo)致T-SPOT.TB在活動(dòng)性結(jié)核病診斷中效果不甚理想[9]。

有報(bào)道顯示，經(jīng)ESAT-6/CFP-10刺激后抗原特異性記憶T細(xì)胞雖在28個(gè)月內(nèi)持續(xù)分泌IFN-γ，但從治療的第6個(gè)月開(kāi)始ESAT-6/CFP-10特異性T細(xì)胞分泌IL-2的數(shù)量顯著增加[10]。且在活動(dòng)性肺結(jié)核治療期間和治療后的28個(gè)月中，ESAT-6/CFP-10特異性T細(xì)胞從開(kāi)始的IFN-γ和IFN-γ/IL-2的CD4+T細(xì)胞共同占優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)變?yōu)橐苑置贗FN-γ/IL-2的CD4+T細(xì)胞為主，并在治療期間和治療后出現(xiàn)只分泌IL-2的CD4+T細(xì)胞。因此，在體外ELISpot檢測(cè)未經(jīng)治療的活動(dòng)性肺結(jié)核中，IFN-γ由兩個(gè)相對(duì)比例不同的CD4+T細(xì)胞功能亞群分泌而來(lái)，且IFN-γ和IL-2分泌CD4+T細(xì)胞呈對(duì)比動(dòng)態(tài)變化，單一的IFN-γ檢測(cè)并不是活動(dòng)性結(jié)核病的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

IL-2具有廣泛的生物活性，在機(jī)體啟動(dòng)的免疫應(yīng)答過(guò)程中，T細(xì)胞和B細(xì)胞增殖分化離不開(kāi)IL-2的激活，且抗原特異性記憶T細(xì)胞在IL-2的刺激下才會(huì)大量分泌IFN-γ對(duì)細(xì)胞免疫應(yīng)答做出快速反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，IL-2與IFN-γ一樣均為MTB感染后CD4+Th1細(xì)胞分泌的結(jié)核特異性細(xì)胞因子，結(jié)核病患者的血液和病灶部位的淋巴細(xì)胞是在IL-2刺激下被激活而釋放入血，且其與機(jī)體感染的炎癥嚴(yán)重水平密切相關(guān)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合檢測(cè)的敏感度為89.3%，而單獨(dú)檢測(cè)IFN-γ的敏感度為87.1%，這表明引入了IL-2作為聯(lián)合診斷標(biāo)志物，增加了結(jié)核病的診斷敏感度。且IFN-γ的特異度僅為74.3%，而IL-2的診斷特異度高達(dá)85.2%。Tan等[12]報(bào)道表明，對(duì)MTB特異性細(xì)胞因子表達(dá)分析證實(shí)，IL-2對(duì)活動(dòng)性結(jié)核病例的特異度高于IFN-γ。在結(jié)核病感染過(guò)程中，MTB特異性T細(xì)胞在慢性感染晚期表達(dá)高水平的PD-1，從而限制了其分泌IL-2而不是IFN-γ的能力[13]。這可能是IL-2在結(jié)核病診斷中的高特異度的合理解釋。本研究結(jié)果顯示當(dāng)IFN-γ和IL-2聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，特異度進(jìn)一步提高到85.7%。同時(shí)，聯(lián)合檢測(cè)的AUC值明顯高于IFN-γ、IL-2的單獨(dú)檢測(cè)，提示聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能更高，這得益于聯(lián)合檢測(cè)結(jié)合了IFN-γ高敏感性和IL-2高特異性的優(yōu)點(diǎn)，能顯著提高結(jié)核病的檢出率。

綜上所述，本次研究說(shuō)明感染MTB后，結(jié)核病患者體內(nèi)T淋巴細(xì)胞中IFN-γ和IL-2的表達(dá)水平急劇升高，可以作為結(jié)核病的診斷標(biāo)志物。且對(duì)結(jié)核病進(jìn)行IFN-γ和IL-2聯(lián)合檢測(cè)，可以有效提高結(jié)核病準(zhǔn)確度并減少漏檢的可能，這為結(jié)核病診治及防控帶來(lái)廣闊的應(yīng)用前景。