海螵蛸提取物活性成分分析及止血機制

劉書豪， 王有憲， 邵仲柏， 蔣凱俊， 曹聯攻， 李 冰， 沈金陽*，劉瑋煒*

(1.江蘇海洋生物資源與環境重點實驗室，江蘇 連云港 222005；2.江蘇海洋大學，江蘇省海洋藥物活性分子篩選重點實驗室，江蘇 連云港 222005；3.江蘇省海洋生物產業技術協同創新中心，江蘇 連云港 222005；4.江蘇海洋大學藥學院，江蘇 連云港 222005)

海螵蛸是頭足綱烏賊科動物無針烏賊或金烏賊的干燥內殼[1]，分布于浙江、福建、山東等沿海地區。碳酸鈣、殼角質與粘液質占其成分含量的90%左右，還含有少量氯化鈉、磷酸鈣、鎂鹽等[2-3]。海螵蛸成分構成中成分眾多[4]，具有極大的研究開發價值。當前，對海螵蛸的研究多集中于治療胃潰瘍和成骨作用[5-7]，但對凝血止血機制的研究報道較少。鄭杰[8]等用黃芪和烏賊骨各30 g，再配伍其他止血藥治療由腎氣虛導致的術后出血不止，在服藥4劑后出血即止，可見海螵蛸可協同他藥發揮止血作用；盛福韶[9]用大黃炭海螵蛸粉，取適量涂于凡士林油紗條上，填塞出血鼻腔，連用7 d，有效率達94.4%。海螵蛸作為一味海洋中藥，其良好的凝血效果已被證實，但是其具體止血機制仍不清楚，其止血活性物質也不明確，并且關于其止血作用機制和體外止血研究鮮有報道。因此，本實驗對海螵蛸提取物進行體外促凝血檢測，探索其活性成分和止血機制。

1 材料

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(河南省予華儀器有限公司)；TDL-40B電動離心機(杭州南開日新生物技術有限公司)；AS-LGJ-10FG冷凍干燥機(鄭州宏朗儀器設備有限公司)；ACLTOPT00LAS全自動血凝分析儀(西班牙巴塞羅那沃芬公司)。云南白藥(云南白藥集團股份有限公司)。新鮮海螵蛸購于連云港新浦區蒼梧生活廣場，經江蘇海洋生物資源與環境重點實驗室劉瑋煒教授鑒定為金烏賊SepiaesculentaHoyle內殼，粉碎研磨制得。昆明種小鼠飼養于南京中醫藥大學康達醫學院，動物生產許可證號SCXK(蘇)2016-0002，動物實驗倫理委員會審批號Jou-2020-Y-01-A。

2 方法

2.1 提取物制備

2.1.1 水提物 藥材研磨后過40目篩，稱取10 g，加去離子水100 mL，室溫浸泡6 h，在80 ℃下攪拌熱回流2 h[10]，濾過，重復提取1次，合并2次水提液，濾渣超聲提取40 min，合并濾液，25 ℃、4 000 r/min離心15 min后取上清，置于60 ℃烘箱中烘干濃縮后，旋轉濃縮至近干，冷凍干燥，即得。

2.1.2 醇提物 取藥材粉末10 g，加100 mL 95%乙醇浸泡24 h，50 ℃加熱回流提取2 h，過濾，濾渣提取1次，超聲提取40 min，合并3次濾液，離心后取上清，蒸干，即得。

2.1.3 石油醚提取物 取藥材粉末10 g，加100 mL石油醚，室溫浸泡[11]一段時間后攪拌2 h，濾過，濾渣用石油醚同法提取1次，超聲提取40 min，合并3次濾液，離心后取上清，蒸干，即得。

2.2 活性成分分析 向盛有供試液的試管中或濾紙片上加入相關的化學試劑，根據反應現象(顏色、沉淀等)來判斷某種活性成分在海螵蛸提取物中是否存在[12]。

2.3 凝血時間檢測 采用摘眼球取血法取小鼠血液，制備枸櫞酸鈉抗凝血液，玻璃試管中加入藥液0.2 mL(37 ℃水浴預溫)，再加入氯化鈣溶液0.2 mL，搖勻后于各管內同時加入小鼠抗凝血液0.5 mL，以云南白藥為陽性對照，生理鹽水為空白對照，置于37 ℃水浴箱中振蕩搖晃后立即計時，每5 s輕輕傾斜試管1次，觀察有無凝血，到傾斜試管血塊凝固于管底而不流動時停止計時，即為凝血時間[13]，重復3次，取平均值。

2.4 凝血四項檢測 采用摘眼球取血法取小鼠血液，制備枸櫞酸鈉抗凝血液(1份抗凝液+9份全血)，輕輕顛倒混勻，3 000 r/m離心15 min，收集上清液。取待測血漿0.1 mL，分為醇提物高(4.0 mg/mL)、中(2.0 mg/mL)、低(1.0 mg/mL)劑量組，水提物高(4.0 mg/mL)、中(2.0 mg/mL)、低(1.0 mg/mL)劑量組，石油醚提取物高(4.0 mg/mL)、中(2.0 mg/mL)、低(1.0 mg/mL)劑量組，云南白藥(2.0 mg/mL)組，加入0.05 mL樣品，另設陰性對照組，加入0.05 mL生理鹽水，混勻，置于全自動血凝分析儀上，檢測凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APPT)、凝血酶時間(TT)、纖維蛋白原(FIB)水平，重復6次，取平均值。

3 結果

3.1 成分分析 由表1可知，海螵蛸提取物可能含有甾體三萜類、揮發油和油脂、皂苷、有機酸、內酯、香豆素、糖類、氨基酸，未發現蛋白質、蒽醌類、酚類、鞣質等成分。

表1 提取物成分分析結果

3.2 提取物對小鼠凝血時間的影響 由表2可知，與空白組比較，水提物組凝血時間縮短(P<0.05)，接近陽性對照組。

表2 提取物對小鼠凝血時間的影響

3.3 提取物對小鼠凝血四項的影響 由表3可知，與空白組比較，水提物各劑量組小鼠PT、APPT縮短(P<0.05)，并呈劑量依賴性，但各提取物組TT、FIB水平均無明顯變化(P>0.05)。

表3 提取物對小鼠凝血四項的影響

4 討論

體外止血實驗表明，海螵蛸提取物中水提物體外促凝效果良好，其活性成分中有良好的體外促凝物質。海螵蛸主要促凝血成分為Ca離子、甲殼素、殼聚糖和提取物多糖[1]，其中甲殼素不溶于水，殼聚糖是甲殼素的脫乙酰化產物，海螵蛸中Ca離子存在形式為其主要成分CaCO3，并且難溶于水，推測活性成分可能為提取物多糖。凝血過程是一系列的酶促反應，包括內源性、外源性、共同凝血3個途徑，使血漿纖維蛋白原變為纖維蛋白，血液由溶膠狀態變為凝膠狀態[14]。凝血四項檢測結果表明，海螵蛸水提物能縮短小鼠PT、APTT，高劑量下更明顯，但TT、FIB基本無變化，其促凝血作用可能與外源性凝血途徑和內源性凝血途徑中影響凝血因子有關，同時其質量濃度提高時可積極影響內源性凝血中促進凝血活酶形成過程中凝血因子、激肽釋放酶原的過程。