葛根芩連湯藥效物質基礎及質量控制研究進展

路立峰， 張媛媛， 李振興， 蔣雨來

(山東藥品食品職業學院藥品技術研發中心，山東 威海 264210)

葛根芩連湯首載于張仲景《傷寒論》，原方名為葛根黃芩黃連湯，亦為后世《醫方類聚》《醫方集解》《傷寒大白》等醫藥典籍所收載，至近代《中國醫藥大辭典》始成葛根芩連湯方名。葛根芩連湯由葛根、黃芩、黃連、炙甘草組成，具有表里雙解、清熱止利之功，為治熱陷陽明、協熱下利常用方，適用于脈促喘而汗出者[1]。現代研究表明，葛根芩連湯具有抗炎抑菌、降血糖、解熱、降血脂、抗氧化等多種藥理作用[2-6]，可用于治療胃腸型感冒、糖尿病、細菌性痢疾、輪狀病毒腸炎、潰瘍性結腸炎等疾病[7-11]，其現代成方制劑有葛根芩連膠囊、片、口服液、顆粒、丸及微丸等，其中丸劑和片劑被2020年版《中國藥典》一部收錄。本文總結葛根芩連湯近十年來在化學成分、藥效物質基礎、制備工藝、鑒別、含量測定等方面的進展，以期為傳統湯劑的傳承、成方制劑的創新開發、質量控制與評價提供參考。

1 化學成分

葛根芩連湯的化學成分主要有黃酮類、生物堿類、皂苷類、酚酸類、香豆素類、木脂素類等[12-13]。其中，黃酮類成分主要來源于葛根、黃芩和甘草，以葛根素、大豆苷、黃芩苷、芒柄花苷、芒柄花素、漢黃芩素、槲皮素為主；生物堿類成分全部來源于黃連，含小檗堿、表小檗堿、黃連堿、藥根堿、巴馬汀等；皂苷類成分主要來源于甘草，有甘草苷、異甘草苷、甘草皂苷G2等；此外，還有綠原酸、葛根香豆素、考邁斯托醇等酚酸類，香豆素類和木脂素類成分。

2 藥效物質基礎研究

2.1 基于成分導向的物質基礎研究 成分導向型物質基礎研究以獲取結構明確的化合物為導向，多注重成分的獲得，而忽視湯液藥效物質的表達，但與網絡藥理學分析、質量標志物預測等技術相結合，可彌補其在方藥系統性和整體性研究方面存有的不足，實現藥效物質的分離和篩選。超高效液相色譜-線性離子阱-靜電場軌道阱組合式高分辨質譜(UPLC-LTQ-Orbitrap-MS)是一種新興技術，能實現未知成分的快速鑒定與分析，已逐漸用于快速識別三七、茯苓、秦艽等中藥飲片的化學成分，然而在中藥湯劑及成方制劑研究中鮮有報道。王婷婷等[12]通過構建化學成分數據庫，對葛根芩連湯中化學成分進行UPLC-LTQ-Orbitrap-MS快速鑒定，完成整體和類群化學成分的推測及成分歸屬，共鑒定得到67個化合物，其中黃酮類36個、生物堿類12個、三萜及三萜皂苷類4個，另有酚酸類、香豆素類、木脂素類和苯乙醇苷類15個，該方法全面、快速、系統地實現葛根芩連湯化學成分的高分辨分析，為葛根芩連湯藥效物質基礎闡釋和質量控制研究提供參考依據。

2.2 基于體外模型的藥效物質研究 目前葛根芩連湯藥效物質篩選研究的模型主要有大鼠腸外翻生物模型、四氧嘧啶致小鼠高血糖模型和鏈尿佐菌素(STZ)復合高脂飼料2型糖尿病模型等，前者主要用于體外腸道吸收的藥效物質基礎篩選，后兩者則用于糖尿病的藥效物質基礎篩選。通過建立腸外翻生物模型，張華等[14]采用HPLC法分析葛根芩連湯及葛根芩連組、芩連組、芩連甘草組這3個不同配伍組的生物堿成分在腸道給藥后的動態變化規律，研究表明，黃連堿、藥根堿、小檗堿、巴馬汀這4個組分在不同腸段的吸收均為線性吸收，符合零級吸收速率，其中小檗堿、巴馬汀的最佳吸收部位為空腸，黃連堿、藥根堿的最佳吸收部位為結腸，并且方中其他藥能促進黃連生物堿類成分的吸收。王躍等[15]以腸道轉運P-糖蛋白抑制劑維拉帕米為依據，進一步研究配伍對黃連生物堿腸吸收特性的影響，研究發現，各生物堿在各腸段的吸收均顯著性增加，且葛根能有效促進十二指腸和空腸段生物堿成分的吸收，黃芩能增加回腸和結腸段黃連堿、小檗堿、巴馬汀成分的吸收，闡明葛根芩連湯復方配伍機制及合理性。葛根芩連湯具有降低血糖的藥理活性，王霜等[16]基于基線等比增減設計研究葛根-黃連藥對不同配比對小鼠血糖的影響，結果發現，葛根-黃連藥對劑量比為3∶8時，降低四氧嘧啶和STZ糖尿病模型血糖效果最佳，并能使正常小鼠血糖降低，對STZ所致糖尿病的血清總膽固醇、甘油三酯降低效果突出。建立在已知靶點基礎上的體外藥效物質研究雖能客觀、系統的反映湯劑的作用機能，但卻無法全面表達機體整體機能。

2.3 基于藥動學的藥效物質研究 葛根芩連湯成分多、靶點多、作用途徑多，其整體藥效作用特征的表達是研究的關鍵科學問題。王琦等[17]通過LC/MS/MS技術對葛根芩連湯42種入血的生物活性成分(標志物)進行分析和藥動學研究，結果表明，甘草酸通過抑制P-糖蛋白提高小檗堿的滲透性，甘草酸與小檗堿配伍后，能增強其抗糖尿病的作用，使血糖下降46.9%，胰島素水平較對照組升高40.8%，并呈劑量依賴性，該方法通過活性成分藥動學的改變，揭示葛根芩連湯協同用藥抗糖尿病的作用機制。毛瑩等[18]發現，葛根芩連湯藥效組分能降低胃排空速度、抑制小腸蠕動而達到良好的止瀉作用。張藝竹等[19]通過液相色譜-串聯質譜結合大鼠腸外翻及在體單向腸道灌流試驗，研究葛根芩連湯不同配伍在大鼠體內藥動學腸吸收，結果顯示，全方配伍能促進葛根素、黃芩苷、小檗堿、甘草苷這4種成分在腸道中的吸收，全方組大鼠體內葛根素、黃芩苷、小檗堿AUC值升高，但同時加快肝藥酶對甘草苷的代謝，使甘草苷AUC值降低，該結果通過藥動學闡釋葛根芩連湯方配伍的原理和機制。張啟云等[20]灌胃給予SD大鼠葛根芩連湯的11種入血成分并進行HPLC-ESI-MS/MS檢測及成分歸屬，采用曲線下面積(AUC0～∞)自定義權重系數建立整合藥動學模型，結果表明，總黃酮、總生物堿類的藥動學參數t1/2、AUC0～∞分別為6.08 h、30.00 mg/L·h和28.86 h、1.07 mg/L·h。該方法從多成分分類整合藥動學的角度，反映出同類化合物整體在生物體內的藥動學變化規律，但該方法在表達整體藥效作用的關聯上，尚存有一定的欠缺。

2.4 基于血清代謝組學的藥效物質研究 湯劑藥效的發揮，與吸收入血成分密切相關，吸收入血成分的鑒定和分析，是當前研究的熱點，也是真實反映藥效物質的核心。張敏等[21-22]采用氫核磁共振代謝組學技術，研究葛根芩連湯對2型糖尿病的干預和高果糖誘導胰島素抵抗大鼠糞便代謝。張敏等[21]鑒定得到15個T2DM潛在生物標志物，并發現葛根芩連湯能不同程度地回調14個標志物，認為其可通過調節能量代謝、脂質代謝、氨基酸代謝等途徑發揮作用，此結果通過研究大鼠血清中內源性代謝物的變化，從代謝組學的角度為其臨床應用提供了實驗數據和理論基礎。汪雙紅等[22]發現，葛根芩連湯能抵抗丙酸、乙酸、琥珀酸、牛磺酸和甘油水平升高，降低正丁酸、丙氨酸和谷氨酸水平，從而改善胰島素抵抗引起的大鼠氨基酸代謝、脂肪酸氧化、腸道微生物代謝等代謝紊亂狀態。該方法雖能客觀真實地反映出入血成分的藥效物質基礎，但卻忽視了動物機體差異性帶來的影響，對無法入血的成分或入血后代謝的部分成分，不能實現有效的辨識與篩選。

2.5 基于譜效關系的藥效物質基礎研究 譜效關系是基于通過化學成分分析，構建化學成分群的特征指紋圖譜，再結合適宜的藥效評價模型，實現中藥指紋圖譜和藥效學的有效關聯，用于評價藥效物質基礎的研究。它受化合物對照品種類及色譜分離技術的限制，尚不能全面表征化學成分的指紋特征。劉文等[23]在超高液相色譜串聯質譜法(UPLC-MS/MS)指紋圖譜基礎上，采用主成分分析及灰色關聯度分析，確定葛根素、大豆苷、黃連堿、表小檗堿、鹽酸藥根堿、黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸銨等主要成分的共同作用，是葛根芩連湯改善濕熱內蘊型潰瘍性結腸炎大鼠模型血清及組織液TNF-α影響的藥效信息物質。

3 質量控制

目前，葛根芩連湯質量控制的研究內容主要集中在粉碎、煎煮、純化精制等關鍵制備工藝，鑒別和含量測定這3個方面，而其出膏率、水分、浸出物、污染物檢查等物質基準研究的文獻報道則少見。

3.1 制備工藝

3.1.1 超微粉碎 超微粉碎是利用機械力或流體動力，使藥材細胞破壁，獲取均勻超微粉末的方法，具有可控性強、適用范圍廣的特點，并能有效提高體外溶出度和節省藥材。劉蕊等[24]研究表明，葛根芩連湯300目超微粉比細粉中的葛根素、黃芩苷溶出含量分別提高56.10%、41.73%，能顯著增強有效成分的溶出度。該研究為藥材的可持續化利用和減少服用量方面提供了有益參考。

3.1.2 煎煮 煎煮是傳統湯劑獲取有效物質或有效物質群組的主要手段，也是決定湯液安全有效的關鍵環節，更是提高湯液質量穩定均一的控制措施。對葛根芩連湯煎煮方面的研究集中在煎法、加水量、煎煮時間、煎煮次數、煮取量等。《傷寒論》中有葛根芩連湯“以水八升，先煮葛根，減二升，內諸藥，煮取二升”的記載，周娜娜等[25]發現，加水量與煮取量的多少能反映出對煎煮時間的把控，并推測出《傷寒論》中葛根芩連湯的煎煮時間應為45 min。王曉軍[26]考察合煎、分煎及共煎對葛根芩連湯有效化學成分的影響，發現分煎劑中葛根素、黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀平均百分含量為1.93%、0.60%、0.14%、0.07%，明顯高于合煎劑及共煎劑，由此推薦分煎法制備葛根芩連湯。文謹等[27]對不同量值(一兩等于13.8 g和一兩等于3 g)下的葛根芩連湯，進行經方本原和現代常規煎煮法比較，發現高量值時，本原法煎煮的湯劑有效成分煎出量和干膏率均低于現代常規法，而低量值時，則均優于現代常規法，提示有效成分的煎出量未能與藥材的使用量成相應的倍數，并為此方的古為今用提供了參考依據。王立等[28]考察葛根芩連湯、黃芩單煎液、黃連單煎液這3種煎煮方式，發現葛根芩連湯中其他成分能對黃芩苷、小檗堿的入血吸收產生顯著影響，并能延長黃芩苷在體內的作用時間。張家成等[29]以葛根素、漢黃芩苷、小檗堿、大豆苷、甘草酸銨、甘草苷、巴馬汀等主要成分溶出量為評價指標，確定最佳煎煮工藝為9倍量水，煎煮時間50 min，發現在相同煎煮時間和次數的條件下，主要成分的溶出量隨加水量的增多而呈現上升趨勢，9倍的加水量為明顯拐點；在相同加水量和煎煮次數條件下，主要成分的溶出量隨煎煮時間的延長亦呈現上升趨勢，50 min為明顯改變點，但在80 min時有些成分的溶出會減少。章軍等[30]基于中醫配伍理論，對君臣佐使藥分配權重系數，進行葛根芩連湯提取工藝的綜合評價，確定最佳煎煮工藝為8倍量水提取3次，每次1 h，此工藝穩定可靠、重復性高、穩定性好，為臨床用藥煎煮和工業生產提供參考。此外，還有動態優化法優化葛根芩連湯提取工藝研究報道。

3.1.3 微生物發酵 微生物發酵是傳統中藥與現代生物技術相結合的新興技術，在提高有效成分含量、獲取新的活性物質、降低副作用、促進生物利用度等方面具有明顯優勢。杜晨暉等[31]通過釀酒酵母ATCC9763、GIM2.9，采用兩步培養法，對葛根芩連湯進行發酵，紫外-可見分光光度法測定發酵樣品總黃酮和總生物堿的含量，結果表明，此方法能夠降低細胞壁的阻滯作用，促進有效成分的溶出，并使總黃酮含量分別提高32.90%、30.20%、總生物堿含量分別提高24.91%、30.89%，為中藥復方制劑的研究與開發提供一種新的思路。李津等[32]對葛根芩連湯進行固態發酵，以發酵產物對酵母靜息細胞的活性作為評價指標，正交試驗優選確定最佳工藝為1∶1的生藥量和面粉量，高溫高壓滅菌，接種15 g/L酵母液，35 ℃發酵5 d，此方法制備的發酵產物生物活性強，能增強酵母靜息細胞葡萄糖代謝能力，并為后期大規模工業化生產提供依據。

3.1.4 殼聚糖絮凝沉降 殼聚糖絮凝沉淀是利用殼聚糖的高吸附性能，與被分離組分結合形成架橋，獲得沉淀絮狀物的一種分離技術。孫星等[33]優選葛根芩連湯殼聚糖絮凝沉降工藝，確定葛根芩連湯中黃酮和生物堿類成分的最佳純化條件為藥液質量濃度0.78 g/mL，殼聚糖加入量10%，藥液pH值6，并進行沉降效果和指紋相似度比較，結果表明，該方法與原藥液HPLC圖最為相似，對小檗堿的損失量較大，而對葛根素、黃芩苷的保留率較高，并認為殼聚糖絮凝沉淀能改變藥液中有效成分之間的組成比例，進而改變藥效性質，應慎重選擇殼聚糖絮凝沉降作為葛根芩連湯的精制工藝。

3.2 鑒別 除薄層色譜鑒別外，色譜指紋鑒別技術如HPLC指紋圖譜、UPLC-MS/MS指紋圖譜、紅外指紋圖譜等，也較多的應用在葛根芩連湯的質量控制研究中。

3.2.1 HPLC指紋圖譜 安叡等[34]采用RE-HPLC法，以甲醇-水(含0.5%甲酸和0.5%三乙胺)為流動相，梯度洗脫，在270 nm波長下以葛根素、黃芩苷、鹽酸小檗堿為藥材參照峰，得到葛根、黃芩、黃連的特征峰群，建立葛根芩連湯和藥材的數字化色譜-指紋圖譜(HPLC-DFPS)，實現對葛根、黃芩、黃連的鑒別，但該方法受制于對照品種類的局限，無法對方中諸藥協同產生的新成分指認，尚不足以實現指紋圖譜主要色譜峰的全面定性。宋麗軍等[35-36]利用HPLC-DAD檢測，在250、280、346 nm波長下識別葛根芩連湯23個特征峰，明確其中12個色譜峰的歸屬，實現對全方4味藥多成分的同時測定，此鑒別方法色譜信息豐富、分離度好、分離時間短，可用于成分的快速鑒定，并有助于葛根芩連湯及各組分的質量控制。

3.2.2 UPLC-MS/MS指紋圖譜 UPLC-MS指紋圖譜具有分離性能強、分離度好、分辨率高的優點，能全面反映待測組分的化學成分信息，可系統表明藥物成分的整體觀。王鈺樂等[37]建立葛根芩連湯UPLC-MS/MS指紋圖譜分析方法，以鹽酸小檗堿為參照峰，UPLC-TQMS檢測，定性鑒定出8個共有峰，確認39個特征指紋峰的歸屬，其中13個來源于葛根，17個來源于黃芩，6個來源于黃連，3個來源于炙甘草，該方法操作簡單、信息量豐富、靈敏度高、分離效果好，為該湯劑的質量控制提供參考依據。

3.2.3 傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)指紋圖譜 與液相色譜指紋圖譜相比，紅外光譜指紋圖譜具有對樣品無損傷、不需摸索色譜條件、可獲取整體宏觀信息的優勢，既能反映中藥內在的物質基礎,又能在宏觀上有效控制中藥整體質量。因其專屬性高，廣泛應用于湯劑的品質評價、組方與拆方機理研究中。越來越多的研究者采用FT-IR技術探究葛根芩連湯紅外指紋特征，徐蓓蕾等[38]確認1 727、1 614、1 509、1 448、1 362、1 272、1 031、838、767、582 cm-1等區域為其紅外指紋特征峰；石玉娟等[39]在研究配伍對葛根芩連湯總多糖含量影響變化時，發現葛根、黃連兩藥配伍后，多糖紅外特征官能團增多，能增加多糖溶出含量；任蕾等[40]根據紅外指紋吸收峰的強弱推測藥效，顯示全方配伍得到的IR指紋特征峰最強最多，甘草能顯著促進葛根素的溶出，黃連能抑制黃芩素的溶出，但黃芩有助于黃連藥效的發揮。

3.3 含量測定

3.3.1 HPLC法 HPLC法簡便快捷、專屬性強、效率高，已廣泛的應用于湯劑與成方制劑的質量控制中。相關學者已采用HPLC-DAD檢測，實現對葛根芩連湯全方四藥中的葛根素、大豆苷、黃芩苷、甘草苷、黃連堿、藥根堿、小檗堿、鹽酸表小檗堿、巴馬汀、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、大豆苷元、甘草酸銨這14種藥效組分含量的同時測定，并完成藥效組分間的結構比確認，可用于全面評價和控制葛根芩連湯質量[41-44]。

3.3.2 UPLC法 張華等[45]將UPLC法與DAD(PDA)檢測結合，在10 min內快速測定葛根芩連湯腸外翻囊樣品中葛根素、大豆苷、甘草苷、野黃芩苷、黃芩苷、漢黃芩苷等6種黃酮類成分的含量，該方法操作簡便、快速準確、靈敏可靠，并為葛根芩連湯大鼠腸吸收動力學研究提供參考。

3.3.3 苯酚-濃硫酸法 多糖是具有廣泛的抗腫瘤、抗微生物、抗氧化、降血脂和調節免疫等生物學活性[46]。石玉娟等[39]采用苯酚-濃硫酸法測定葛根芩連湯不同配伍對總多糖含量的影響，研究表明，葛根與黃芩、甘草、黃連不同配伍時，多糖含量分別為1.46%、1.48%、0.99%，該研究為葛根芩連湯多糖臨床藥效的發揮提供數據支持。

3.3.4 ICP-AES法 微量元素離子對中藥湯劑功效的表達具有重要意義，若超出限度或過多，就會危害人體健康。尹愛武等[47]對葛根芩連湯進行不同煎煮時間的ICP-AES法無機元素測定，結果表明，煎煮時間為60 min時煎液中Ca、Mg、Zn、Fe、Mn、Cu、Sr含量分別為473.39、594.04、4.71、40.33、5.40、1.75、4.93 μg/g，與90 min的煎液差別不大，且2種煎液中均未檢測到Co、Ni、Cd、Pb這4種有害元素，該方法為葛根芩連湯的質量控制和臨床應用提供參考依據。

綜上所述，在測定成分的選擇上，以藥效活性物質為導向，表現湯液質量；在成分的測定上，趨向多成分的同時測定，實現湯液質量控制；在測定技術的選擇上，以快速、全面、準確為目標，評價湯液控制質量；在湯液的臨床使用上，以安全、有效為目的，突出湯液藥品特性。可以預測的是，針對葛根芩連湯基準物質研究的不足，當以《古代經典名方中藥復方制劑簡化注冊審批管理規定》為技術要求，完善相關研究，夯實制劑質控基礎，進而促進該方制劑的注冊，推進品種的二次開發。

4 結語

中醫藥學是一個偉大寶庫，應當努力發掘，加以提高。隨著中醫藥發展上升為國家戰略，以葛根芩連湯為代表的經典名方的現代化是中藥現代化的重要組成部分，也是傳承精華的主陣地，更是守正創新的突破口。湯劑的研究，雖在化學成分、藥效物質和質量控制方面取得了一定的發展，但依然道阻且長。基于此，以下幾點仍需思考：①湯劑研究應突出臨床價值導向。湯劑來源于臨床，應用于臨床，反饋于臨床，臨床療效是其生命線，也是檢驗湯劑質量優劣的標準線，故其研究設計當以臨床療效為中心，以藥效物質基礎研究和質量控制研究為2個基本點；以藥效物質基礎研究探討其作用機制，表達釋其功能主治；以湯劑質量控制研究進行制劑研發，保障其制劑屬性，協同促進臨床療效。②藥效物質基礎研究是闡釋臨床功效和作用本質的核心，其研究的思路和方法也呈現出多元化、多樣化，但仍有一定程度的不足和局限。對湯劑藥效物質基礎的研究，一是堅持動態發展理念，引入計算機現代技術，對藥效物質進行精準辨識、篩選與預測，再結合真實世界的藥理試驗，評價其真實性，尋找到能代表其藥效的物質基礎；二是堅持中醫整體觀念，建立多學科交融，多層次篩選和多維評價的研究模式，實現方證效應表達，全面、系統地揭示湯劑的物質基礎，闡釋其作用機制和配伍規律。③在質量控制研究中，借鑒新技術、新方法，引進新設計、新理念，進行處方篩選、工藝優化、穩定性研究、臨床安全性評價等全方位、動態性的過程控制評價，實現傳統湯劑的整體觀質量評價。在制劑研發中，從藥味來源、工藝設計、質量標準到物質基準研究，遵循臨床用藥需求，促進整體質量傳遞，推進中藥質量控制的整體轉變；在標準制定上，淘汰能耗高、成本高、污染大的檢驗方法，堅持綠色、環保、低毒的新模式，構建綠色集成標準，增強科技與經濟價值；在原料把控上，從種植、采收、加工到流通，嚴格控制藥材質量，建立可追溯的綠色質量控制體系；在制劑生產中，從投料、提取、制備到包裝，嚴控每一生產環節，明確關鍵質量屬性，建立全過程的綠色制造質量控制體系，培育和造就一批臨床價值高、科技含量足、競爭力強的名優品種，推進中醫藥的高質量發展。