小檗堿通過PERK-ATF4通路對高糖誘導的血管平滑肌細胞鈣化的改善作用

段書眾， 于文會， 張 華， 王景福*

(1.承德醫學院附屬醫院腎臟內科，河北 承德 067000；2.承德醫學院附屬醫院藥學部，河北 承德 067000)

糖尿病是臨床常見的代謝障礙疾病，近年來發病人數不斷增長，已成為嚴重威脅人類健康的全球性疾病[1]。血管并發癥是糖尿病患者常見的一類并發癥，發病率高、危險性大[2]，而血管鈣化是糖尿病發生血管并發癥的主要特征，是增加糖尿病患者心血管疾病發病率、死亡率的重要推手[3]。因此，探索糖尿病血管鈣化的潛在作用機制，并采取有效防治措施具有重要意義。目前研究認為，血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)由收縮表型轉化為成骨表型是血管鈣化形成的共同基礎[4]。蛋白激酶R樣內質網激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)-激活轉錄因子4(activating transcription factor 4，ATF4)是內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)的經典信號通路，通過PERK發生自身磷酸化，進而誘導ATF4表達發揮作用[5]。研究發現，ERS可能介導高糖引起VSMC鈣化的過程[6]。

小檗堿是廣泛存在于黃柏、黃連等傳統中草藥中的植物堿，具有降脂、降糖、抗炎、抗氧化等作用[7]。目前研究表明，小檗堿能緩解ERS，且其對代謝綜合征器官損害的保護作用可能與改善ERS有關[8]。另有研究發現，小檗堿對血小板源生長因子誘導的VSMC鈣化具有抑制作用[9]。本研究將基于PERK-ATF4通路，探討小檗堿對高糖誘導的VSMC鈣化的減輕作用。

1 材料

1.1 細胞 大鼠胸主動脈平滑肌細胞VSMC(貨號FE563)購自美國ATCC庫，用含10%胎牛血清的DMEM培養基，于在37 ℃、5% CO2培養箱中培養，待細胞長滿后，傳代3次用于后續實驗。

1.2 試劑與藥物 小檗堿對照品(純度≥97%，貨號B832574)購自北京泰澤嘉業科技發展有限公司。DMEM培養基(貨號90113)購自北京索萊寶科技有限公司；pcDNA、pcDNA-ATF4由上海易匯生物科技有限公司構建；鈣離子比色法檢測試劑盒(貨號XG-E98821)購自上海西格生物科技有限公司；BCA蛋白檢測試劑盒、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)檢測試劑盒(貨號ALH371-QIP、GL2018-RDH)購自北京百奧萊博科技有限公司；p-PERK抗體、PERK抗體(貨號3192、3179)購自美國Cell Signaling Technology公司；ATF4抗體、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)抗體、Runt相關轉錄因子2(Runt related transcription factor 2，Runx2)抗體、Osterix抗體、GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(貨號ab23760、ab75285、ab23981、ab209484、ab245356、ab7090)購自英國Abcam公司。

1.3 儀器 NAPCO-8800型恒溫培養箱購自美國Shellab公司；Stat Fax-2100型酶標儀購自美國Awareness公司；AlphaImager Mini型凝膠成像系統購自美國ProteinSimple公司。

2 方法

2.1 細胞分組及給藥 取對數生長期VSMC細胞，以每孔4.0×104個的密度接種于24孔板，分為對照組，高糖組，小檗堿低、中、高劑量組，小檗堿+pcDNA組，小檗堿+pcDNA-ATF4組。高糖組培養基中加35 mmol/L葡萄糖；小檗堿低、中、高劑量組加35 mmol/L葡萄糖和濃度分別為50、100、200 μmol/L的小檗堿；小檗堿+pcDNA組、小檗堿+pcDNA-ATF4組加35 mmol/L葡萄糖和200 μmol/L小檗堿，同時VSMC細胞分別轉染pcDNA、pcDNA-ATF4。小檗堿高劑量組、小檗堿+pcDNA組、小檗堿+pcDNA-ATF4組VSMC細胞培養48 h，RT-qPCR法檢測細胞中ATF4 mRNA表達情況，以驗證轉染效率，內參基因為β-actin，結果通過2-ΔΔCT法計算表示。

2.2 甲基百里香酚藍比色法檢測鈣水平 各組VSMC細胞培養7 d，用PBS沖洗3次，每孔加入1 mL 0.6 mol/L HCl，于37 ℃環境中脫鈣1 h，離心分離上清液，采用鈣離子比色法檢測試劑盒檢測上清液中鈣濃度；剩余細胞用細胞裂解液裂解30 min，BCA法測定細胞蛋白濃度，將上清液中鈣濃度用細胞蛋白濃度加以校正，即上清液中鈣濃度/細胞蛋白濃度表示鈣相對水平。

2.3 磷酸苯二鈉法檢測ALP活性 各組VSMC細胞培養7 d，用PBS沖洗3次，每孔加入l mL含1% TritonX的生理鹽水，于4 ℃環境中放置24 h，超聲裂解細胞30 s，離心分離上清液，采用ALP檢測試劑盒檢測ALP活性；剩余細胞用細胞裂解液裂解30 min，BCA法測定細胞蛋白濃度，將上清液ALP活性用細胞蛋白濃度加以校正，即上清液中ALP活性/細胞蛋白濃度表示ALP活性。

2.4 Western blot法檢測細胞中PERK-ATF4通路及骨相關蛋白表達 各組VSMC細胞培養7 d，離心收集細胞，用含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定細胞蛋白表達，電泳分離目標蛋白，轉膜，脫脂奶粉封閉1 h，將膜放入相應蛋白抗體稀釋液(p-PERK抗體、PERK抗體、ATF4抗體、OPN抗體、Runx2抗體、Osterix抗體、GAPDH抗體，均1∶1 500稀釋)中4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，將膜放入用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗稀釋液(1∶3 000)中室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL法顯色，曝光，凝膠成像系統掃描圖像，將目的蛋白條帶灰度值用內參蛋白GAPDH條帶灰度值加以校正，即目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白GAPDH條帶灰度值表示目的蛋白相對表達。

3 結果

3.1 轉染效率驗證 小檗堿高劑量組與小檗堿+pcDNA組VSMC細胞中ATF4 mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)；與小檗堿+pcDNA組比較，小檗堿+pcDNA-ATF4組VSMC細胞中ATF4 mRNA表達升高(P<0.05)，見表1。

表1 各組VSMC細胞中ATF4 mRNA表達比較

3.2 小檗堿對VSMC細胞鈣水平的影響 與對照組比較，高糖組VSMC細胞鈣水平升高(P<0.05)；與高糖組比較，小檗堿各劑量組VSMC細胞鈣水平降低(P<0.05)，并呈劑量依賴性；小檗堿高劑量組與小檗堿+pcDNA組VSMC細胞鈣水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；與小檗堿+pcDNA組比較，小檗堿+pcDNA-ATF4組VSMC細胞鈣水平升高(P<0.05)，見表2。

表2 各組VSMC細胞鈣水平比較

3.3 小檗堿對VSMC細胞ALP活性的影響 與對照組比較，高糖組VSMC細胞ALP活性升高(P<0.05)；與高糖組比較，小檗堿各劑量組VSMC細胞ALP活性降低(P<0.05)，并呈劑量依賴性；小檗堿高劑量組與小檗堿+pcDNA組VSMC細胞ALP活性比較，差異無統計學意義(P>0.05)；與小檗堿+pcDNA組比較，小檗堿+pcDNA-ATF4組VSMC細胞ALP活性升高(P<0.05)，見表3。

表3 各組VSMC細胞ALP活性比較

3.4 小檗堿對VSMC細胞中PERK-ATF4通路及骨相關蛋白表達的影響 與對照組比較，高糖組VSMC細胞中p-PERK/PERK、ATF4、OPN、Runx2、Osterix蛋白表達升高(P<0.05)；與高糖組比較，小檗堿各劑量組VSMC細胞中p-PERK/PERK、ATF4、OPN、Runx2、Osterix蛋白表達降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性；小檗堿高劑量組與小檗堿+pcDNA組VSMC細胞中p-PERK/PERK、ATF4、OPN、Runx2、Osterix蛋白表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)；與小檗堿+pcDNA組比較，小檗堿+pcDNA-ATF4組VSMC細胞中p-PERK/PERK蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)，ATF4、OPN、Runx2、Osterix蛋白表達升高(P<0.05)，見圖1、表4。

表4 各組VSMC細胞中p-PERK、PERK、ATF4、OPN、Runx2、Osterix蛋白表達比較

4 討論

血管鈣化是引起糖尿病并發心血管疾病的危險因素，同時是升高疾病死亡率的重要原因[10]。VSMC是參與血管鈣化發生的主要細胞，在受到高糖、氧化應激等刺激因素的作用后，由收縮表型向成骨樣細胞表型轉化，并分泌大量骨相關蛋白，從而誘導細胞鈣化發生[11]。本研究采用含高糖的培養液模擬糖尿病機體內的高糖環境，發現高糖組VSMC細胞鈣水平、ALP活性及細胞中成骨細胞標志物OPN、Runx2、Osterix蛋白表達均升高，提示高糖能促進VSMC細胞中鈣離子沉積，并誘導VSMC細胞轉分化為成骨樣細胞，即發生鈣化。

內質網是動態膜性細胞器，含有大量伴侶蛋白、糖基化酶及氧化還原酶，具有蛋白質合成、修飾、折疊、脂質、類固醇、糖原合成及鈣儲存、鈣穩態維持等多種功能[12]。內質網被外界環境刺激后，會發生ERS，影響許多蛋白質的合成過程[13]。曾蓉等[14]研究表明，過度的ERS會促進血管鈣化的發生發展。PERK-ATF4是經典的ERS途徑，在ERS發生時，PERK解除與葡萄糖調節蛋白78的結合狀態，活化形成p-PERK，可通過將eIF2α磷酸化阻斷合成過程，同時上調ATF4表達發揮作用[15]。沈潔等[16]研究顯示，降低大鼠血糖，緩解炎性反應，可減輕ERS并抑制PERK/ATF4/CHOP信號通路激活。本研究顯示，高糖組VSMC細胞中p-PERK/PERK、ATF4蛋白表達升高，提示高糖環境會誘導VSMC細胞中PERK-ATF4通路激活，發生ERS，可能與VSMC細胞鈣化存在一定聯系。

小檗堿是中草藥提取物，在糖脂代謝、氧化應激、炎癥反應等調節方面發揮重要作用[17]。張勇等[18]研究發現，小檗堿對果糖誘導的HK-2細胞內PERK通路激活過程具有抑制作用。張楠等[19]研究亦表明，小檗堿對大鼠脂肪肝缺血再灌注損傷的保護作用可能與抑制ERS有關。Li等[20]研究發現，小檗堿能調節高脂肪飲食小鼠的血脂水平，減輕炎癥損傷及血管鈣化，可能在改善動脈粥樣硬化及心血管保護中發揮作用。本研究顯示，使用不同濃度小檗堿處理高糖誘導的VSMC細胞，細胞中p-PERK/PERK、ATF4蛋白表達降低，同時鈣水平、ALP活性及細胞中成骨細胞標志物OPN、Runx2、Osterix蛋白表達均降低，且均呈劑量依賴性，提示小檗堿可以抑制PERK-ATF4通路激活，并減少VSMC細胞中鈣離子沉積，減輕VSMC細胞鈣化，但小檗堿對高糖誘導VSMC細胞鈣化的減輕作用是否與抑制PERK-ATF4通路激活有關，尚缺乏驗證。

為進一步探索PERK-ATF4通路在小檗堿減輕高糖誘導VSMC細胞鈣化過程中發揮的作用，本研究通過向VSMC細胞轉染pcDNA-ATF4上調ATF4表達，發現高糖、高濃度小檗堿處理下，上調VSMC細胞中ATF4表達后，VSMC細胞鈣水平、ALP活性及細胞中成骨細胞標志物OPN、Runx2、Osterix蛋白表達均升高，提示PERK-ATF4通路激活與VSMC細胞鈣化有關，小檗堿可能通過抑制PERK-ATF4通路激活，對高糖誘導VSMC細胞鈣化起抑制作用。

綜上所述，小檗堿能減輕高糖誘導的VSMC細胞鈣化，其機制可能與抑制PERK-ATF4通路激活有關。