腦寧糖漿的鎮(zhèn)靜催眠作用及其對睡眠剝奪小鼠神經(jīng)遞質的影響

李子恒， 陶正恒， 楊元喜， 汪宏章， 吳 威， 游秋云， 王 平*

(1.湖北中醫(yī)藥大學，湖北 武漢 430065，2.湖北太子藥業(yè)有限公司，湖北 荊門 448000)

失眠癥在情境、復發(fā)或慢性等特點的基礎上影響大部分人口，并且是醫(yī)療實踐中最常見的主訴之一[1]。目前，用于緩解失眠癥狀的西藥主要是安定類藥物[2-3]，因易產(chǎn)生藥物殘留效應、成癮性等影響而不適合長期服用。而中藥治療失眠可以規(guī)避西藥帶來的負面影響，具有一定的優(yōu)越性。

腦寧糖漿主要由鮮松針、大棗、靈芝組成，具有補益氣血、養(yǎng)心安神的功效，是治療心神不寧所致的失眠、心煩、焦慮等癥狀的安全有效的中成藥。經(jīng)多年臨床治療證明[4]，其對睡眠障礙、焦慮、植物神經(jīng)功能紊亂等神經(jīng)官能癥有較好療效，且毒性較小，無耐受性和成癮性。本研究通過對腦寧糖漿的鎮(zhèn)靜催眠作用及其作用機制，以及治療失眠的特點進行探索，以期為臨床治療失眠提供指導和思路，為腦寧糖漿的藥性理論和應用提供可靠依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 SPF級昆明小鼠260只，雌雄各半，體質量(20±2)g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(遼)2020-0001。所有小鼠均飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學老年醫(yī)學研究所動物房，飼養(yǎng)環(huán)境為室溫(25±1)℃，自由飲食，適應性飼養(yǎng)7 d，觀察其一般狀況。本研究獲得湖北中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準(HUCMS202110001)。

1.2 試劑與藥物 腦寧糖漿(批號20210301，湖北太子藥業(yè)有限公司)；舒樂安定購自湖北中醫(yī)藥大學校醫(yī)院。三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇(批號10006818、80109218、10009218，國藥集團化學試劑有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，批號163629、161387，美國Fisher Scientific公司)；甲酸(分析純，批號FA-3116-0500，美國ACS恩科化學公司)。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)對照品(批號43811、H-093，美國Sigma-Aldrich公司)；戊巴比妥鈉(德國默克公司)；RNA提取液、逆轉錄試劑盒、2×SYBR Green qPCR Master Mix(批號G3013、G3330、G3322，武漢賽維爾生物科技有限公司)。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 儀器 自發(fā)活動分析系統(tǒng)(安徽正華生物儀器設備有限公司)；TP-1200C型電子天平(湘儀天平儀器設備有限公司)；AL204型電子精密天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；6420 Triple Quad LC/MS三重四極桿液質聯(lián)用系統(tǒng)(美國Agilent Technologies公司)；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)；KDC2046型低速冷凍離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)；CFX96型聚合酶鏈式反應(PCR)擴增儀(美國Bio-Rad公司)；Epoch酶標檢測儀(美國BioTeK公司)。

2 方法

2.1 行為學實驗

2.1.1 分組及給藥 將144只小鼠隨機分為4組，即正常組，舒樂安定組，腦寧糖漿低、高劑量組，每組36只。舒樂安定組小鼠灌胃給予0.26 mg/kg舒樂安定，腦寧糖漿低、高劑量組灌胃給予15.6、31.2 mL/kg腦寧糖漿(約人臨床等效劑量的2、4倍)，正常組灌胃給予等體積生理鹽水，給藥容量為0.2 mL/10 g，每天1次，連續(xù)14 d。對小鼠自主活動、閾上劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠時間、閾下劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠時間進行檢測。

2.1.2 小鼠自主活動檢測 隨機取各組小鼠12只，第14天給藥后30 min進行小鼠自主活動檢測。實驗前打開自主活動分析系統(tǒng)，設置好程序，實驗時將小鼠放入實驗箱內，讓其適應2 min，隨后點擊分析系統(tǒng)，記錄3 min內小鼠的活動時間及活動路程。

2.1.3 閾上劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠時間檢測 隨機取各組小鼠12只，第14天給藥后30 min，戊巴比妥鈉按閾上劑量(預實驗測得引起100%小鼠睡眠的最小劑量，為33 mg/kg)進行腹腔注射，記錄30 min內小鼠睡眠潛伏期[腹腔注射至翻正反射消失(1 min以上)的時間]及睡眠持續(xù)時間(翻正反射消失至恢復的時間)。

2.1.4 閾下劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠時間檢測 隨機取各組小鼠12只，第14天給藥后30 min，戊巴比妥鈉按閾上劑量(預實驗測得引起90%～100%的小鼠翻正反射不消失的最大劑量，為28.5 mg/kg)進行腹腔注射，以小鼠翻正反射消失1 min以上者為發(fā)生睡眠，統(tǒng)計30 min內各組小鼠的入睡率，公式為入睡率=(各組入睡小鼠數(shù)/各組小鼠總數(shù))×100%。

2.2 腦寧糖漿對睡眠剝奪小鼠的作用

2.2.1 造模、分組及給藥 將75只小鼠隨機分為5組，即正常組，模型組，舒樂安定組及腦寧糖漿低、高劑量組，每組15只，按“2.1.1”項下方法給藥，模型組灌胃給予等體積生理鹽水。從第15天開始，使用改良的多平臺水環(huán)境法建立急性睡眠剝奪模型，除正常組外，其余各組小鼠連續(xù)睡眠剝奪72 h，其間持續(xù)給藥。實驗終點時取小鼠全腦，每組3只，置于福爾馬林溶液中固定，進行免疫組化染色；其余分離出大腦皮層和下丘腦，用于各指標檢測。

2.2.2 LC-MS法檢測大腦皮層中GABA、5-HT含量 精密稱取小鼠大腦皮層50 mg，采用LC-MS法檢測大腦皮層中GABA、5-HT含量。

2.2.3 ELISA法檢測下丘腦中orexin水平 取小鼠下丘腦適量，研碎后加入9倍量0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)，迅速勻漿，取上清液，嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作，采用酶標儀測定吸光度，計算orexin水平。

2.2.4 免疫組化法檢測大腦皮層中GABAAR表達 取經(jīng)過福爾馬林固定的小鼠全腦，經(jīng)脫水、石蠟包埋后切片，烘烤、脫蠟后置于檸檬酸抗原修復緩沖液(pH 6.0)中，于微波爐內進行抗原修復，用3%雙氧水溶液阻斷內源性過氧化物酶，3%BSA室溫封閉30 min，加一抗(GABAAR，1∶300)4 ℃孵育過夜，滴加二抗室溫孵育50 min，滴加新鮮配制的DAB顯色液，在顯微鏡下控制顯色時間，蘇木素復染細胞核，中性樹膠封片，顯微鏡觀察并拍照，采用Image-Pro Plus軟件分析平均光密度值，以其表示蛋白表達程度。

2.2.5 RT-qPCR法檢測大腦皮層中GABAAR、5-HT1AR和下丘腦orexinmRNA表達 取小鼠大腦皮層和下丘腦適量，研碎后提取mRNA，按逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄，反應條件為42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。逆轉錄后的cDNA按照SYBR Green qPCR Master Mix(High ROX)試劑盒說明書配置反應體系，于PCR儀中進行擴增，反應條件為 95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共40個循環(huán)，結果以2-ΔΔCT法進行計算。

3 結果

3.1 腦寧糖漿對小鼠自主活動的影響 與正常組比較，各給藥組小鼠自主活動時間、活動路程、活動速度減少(P<0.01)，見表2。

表2 腦寧糖漿對小鼠自主活動的影響

3.2 腦寧糖漿對閾上劑量戊巴比妥鈉的協(xié)同作用 與正常組比較，各給藥組小鼠睡眠潛伏期縮短(P<0.01)，睡眠時間延長(P<0.01)，見表3。

表3 腦寧糖漿對閾上劑量戊巴比妥鈉的協(xié)同作用

3.3 腦寧糖漿對閾下劑量戊巴比妥鈉所致小鼠入睡率的影響 與正常組比較，各給藥組入睡率增加(P<0.01)，見表4。

表4 腦寧糖漿對閾下劑量戊巴比妥鈉所致小鼠入睡率的影響

3.4 腦寧糖漿對小鼠大腦皮層中GABA、5-HT含量的影響 與正常組比較，模型組小鼠大腦皮層中GABA、5-HT含量降低(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組小鼠大腦皮層中GABA、5-HT含量升高(P<0.05，P<0.01)，見表5。

表5 腦寧糖漿對小鼠大腦皮層中GABA、5-HT含量的影響

3.5 腦寧糖漿對小鼠下丘腦orexin水平的影響 與正常組比較，模型組小鼠下丘腦orexin水平升高(P<0.01)；與模型組比較, 各給藥組小鼠下丘腦orexin水平降低(P<0.01)，見表6。

表6 腦寧糖漿對小鼠下丘腦orexin水平的影響

3.6 腦寧糖漿對小鼠大腦皮層中GABAAR蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組GABAAR陽性表達平均光密度值降低(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組GABAAR陽性表達平均光密度值升高(P<0.05，P<0.01)，見表7、圖1。

表7 腦寧糖漿對小鼠大腦皮層中GABAAR蛋白表達的影響

3.7 腦寧糖漿對小鼠大腦皮層中GABAAR、5-HT1AR和下丘腦中orexinmRNA表達的影響 與正常組比較，模型組小鼠大腦皮層中GABAAR、5-HT1ARmRNA表達降低(P<0.01)，下丘腦中orexinmRNA表達升高(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組小鼠大腦皮層中GABAAR、5-HT1ARmRNA表達升高(P<0.05，P<0.01)，下丘腦中orexinmRNA表達降低(P<0.05，P<0.01)，見表8。

表8 腦寧糖漿對小鼠大腦皮層中GABAAR、5-HT1AR和下丘腦中orexin mRNA表達的影響

4 討論

GABA與5-HT等神經(jīng)遞質及其受體與睡眠關系密切[5]。GABA主要分布在大腦皮質、下丘腦、腦干、海馬、基底神經(jīng)節(jié)等部位，被認為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中啟動和維持睡眠的重要抑制性神經(jīng)遞質[6-7]，具有抵抗焦慮[8]、鎮(zhèn)定神經(jīng)以及治療癲癇等功能[9]。研究應用睡眠剝奪箱、水平臺、限制行動、腹腔注射對氯苯丙胺等方法復制失眠模型，并觀察下丘腦和皮層內GABA水平[10-14]，發(fā)現(xiàn)動物腦內不同部位的GABA水平均下降，GABAAR表達下調，經(jīng)過中藥干預后GABA水平上升，GABAAR表達回升，使失眠癥狀得到改善。5-HT是一種抑制性神經(jīng)遞質，在大腦皮層以及神經(jīng)突觸內含量很高[15]，破壞動物的5-HT能神經(jīng)元或神經(jīng)末梢，會使腦內5-HT減少，導致失眠。同時多項研究表明，睡眠剝奪模型大鼠5-HT1AR水平下降，給予干預手段后，睡眠剝奪模型大鼠5-HT1AR水平升高，睡眠得到改善[16-17]。有關抑郁癥研究提出的“單胺類神經(jīng)遞質能假說”認為，5-HT與其他中樞神經(jīng)遞質一起參與行為活動、情緒、食欲調節(jié)等，5-HT能神經(jīng)傳遞機能的減退不僅導致情緒障礙如抑郁與焦慮的形成，而且還可通過影響其它遞質的活動誘發(fā)抑郁癥[18]，因此，5-HT是抑郁癥與睡眠障礙在神經(jīng)遞質上共性的體現(xiàn)所在。在抑郁癥的發(fā)病過程中，GABA功能缺陷也伴隨其中，并且與5-HT系統(tǒng)具有交互調節(jié)作用，GABA可以增強5-HT系統(tǒng)的功能，GABA受體拮抗劑可以影響5-HT系統(tǒng)表現(xiàn)出類似抑郁的癥狀[19]。

orexin是由下丘腦神經(jīng)元分泌的具有興奮性的神經(jīng)肽類物質，其主要生理功能之一為調節(jié)睡眠和晝夜節(jié)律[20-21]，睡眠剝奪會引起其在腦中水平的改變[22-23]。失眠癥患者的orexin水平高于正常睡眠者，且與失眠的過程和嚴重程度有關[24]。另有研究指出[25-26]，在睡眠狀態(tài)下orexin神經(jīng)元處于相對靜息狀態(tài)，在清醒狀態(tài)下orexin神經(jīng)元激活即刻早期基因c-fos，放電頻率增加，并且腦脊液中orexin水平增多，因此，在睡眠開始時orexin水平會下降，睡眠剝奪后orexin-A分泌增加。各項研究指出，中醫(yī)藥治療失眠的機制之一可能是調節(jié)orexin及其受體。張強等[27]發(fā)現(xiàn)，和胃安神方可下調失眠模型大鼠下丘腦中orexin-A水平以改善睡眠；全世建等[28]對睡眠剝奪大鼠使用交泰丸方灌胃，發(fā)現(xiàn)其鎮(zhèn)靜催眠作用可能是抑制了大鼠下丘腦促覺醒神經(jīng)遞質orexin-A水平。

綜上所述，腦寧糖漿既可減少小鼠自主活動時間、活動路程、活動速度，也能縮短小鼠睡眠潛伏期并延長睡眠時間，且呈劑量依賴性，表明腦寧糖漿在臨床建議劑量范圍內具有良好的鎮(zhèn)靜安神作用，其機制可能是通過上調GABA、5-HT含量和GABAAR、5-HT1AR表達，下調orexin表達來實現(xiàn)的。