桂枝茯苓丸含藥血清對多囊卵巢綜合征小鼠卵巢顆粒細胞自噬的影響

陳海燕， 朱鴻秋， 朱 影， 胡小丹， 吳沛娟， 吳晗雪

(1.成都中醫藥大學，四川 成都 610072；2.成都中醫藥大學醫學與生命科學院，四川 成都 610072)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一種以雄激素過高、排卵障礙和卵巢多囊樣改變為臨床特征的內分泌紊亂綜合征，也是導致育齡期女性月經失調和不孕的重要原因[1]，絕經期患者發生高血壓、糖尿病、心血管疾病、子宮內膜癌的風險較健康女性明顯增高[2]，是危害女性健康的難治病。目前，治療PCOS大多采用生活方式干預、激素或手術的綜合方案，但存在治療周期長、并發癥多、療效欠佳等問題。

桂枝茯苓丸作為婦科經典名方，既往研究發現其輔助治療PCOS，在調整內分泌、改善代謝水平、促排卵等方面效果甚佳[3-4]。課題組前期研究發現，桂枝茯苓丸可調控PI3K/Akt/mTOR信號通路，抑制PCOS大鼠卵巢顆粒細胞過度自噬，從而緩解PCOS大鼠的排卵障礙[5]，但其對自噬更深層次的調控機制尚不明確。研究表明，lncRNAH19和miR-29b-3p不僅參與卵巢功能的調控及有關疾病的發生[6-7]，而且與全身多處細胞自噬調節有關。因此，本研究通過探討桂枝茯苓丸含藥血清是否可以調節H19/miR-29b-3p表達，參與卵巢顆粒細胞自噬的調控，以期為桂枝茯苓丸治療PCOS提供一定的依據，并為后續的治療提供基因靶點。

1 材料

1.1 動物 40只SPF級雌性BALB/c小鼠，體質量18～20 g，未孕，6周齡，購于南京大學動物模式中心，實驗動物生產許可證號SCXK(蘇)2015-0001，飼養于成都中醫藥大學實驗動物研究中心，設定室內溫度為(22±2)℃，自由飲水進食，實驗動物使用許可證號SYXK(川)2019-049。動物實驗內容經成都中醫藥大學實驗動物倫理委員會審核通過。

1.2 細胞株 正常小鼠卵巢顆粒細胞；PCOS小鼠卵巢顆粒細胞，為實驗室自行提取。

1.3 試劑與藥物 桂枝茯苓丸(成都九芝堂金鼎藥業有限公司，批號Z2002370)，取140.4 mg，研缽研磨后加入20 mL無菌生理鹽水制成混懸液。胎牛血清(FBS)(美國HyClone公司，批號SH30071.03HI)；DMEM F12培養基(美國Gibco公司，批號31330095)；青霉素、鏈霉素、巴佛洛霉素A1、嘌呤霉素(美國Sigma公司，批號I9532、85886、196000、540222)；睪酮(T)ELISA試劑盒(美國R&D公司，批號KGE010)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(江蘇凱基生物技術有限公司，批號KGA224)；十二烷基硫酸鈉[生工生物工程(上海)股份有限公司，批號A100227]；蛋白裂解液(RIPA)(上海碧云天生物技術有限公司，批號P0013B)；q-PCR試劑盒、Trizol試劑、質粒抽提試劑盒(日本TaKaRa公司，批號RR014A、9108Q、6023D)；SYBR Green miRNA熒光定量PCR試劑盒、組織/細胞miRNA提取試劑盒(哈爾濱新?；驒z測有限公司)；iScript cDNA合成試劑盒(美國Bio-Rad公司，批號1708890)；pLVX-EGFP-C1載體(美國Creative Biogene公司，批號OVT2755)；Lipofectamine? RNAiMAX、Lipofectamine 3000(美國Thermo Fisher公司，批號13778030、L3000001)；螢火蟲熒光素酶報告基因檢測試劑盒、QuickMutationTMPlus基因定點突變試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，批號RG052S、D0208S)；pMIR-REPORT 質粒(美國Ambion公司，批號AM5795)；微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)B抗體(美國CST公司，批號2775)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體、辣根過氧化物酶(HRP)山羊抗兔、兔抗小鼠免疫球蛋白 G(IgG)(英國Abcam公司，批號ab8245、ab6721、ab6728)。miR-29b-3pinhibitor(序列UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU)、inhibitor-NC(序列 CAGUACUUUUGUGUAGUACAA)(南京達恩醫藥科技有限公司)。

1.4 儀器 Criterion型電泳槽、Trans-Blot型轉印槽(美國Bio-Rad公司)；Tanon 6600型發光成像工作站(上海天能科技有限公司)；3K15型低溫高速離心機(美國Sigma公司)；EG1150H型石蠟包埋機、RM2245型切片機(德國Leica公司)；CKX31型倒置相差顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；LB941型微孔板式多功能酶標儀(德國Berthold公司)；ZS-MV-IV型小動物麻醉機(北京眾實迪創科技發展有限責任公司)；DxFlex型流式細胞儀(美國Beckman公司)；7500型實時熒光定量PCR 儀(美國ABI公司)；Nanodrop 2000型超微量分光光度計(美國Thermo Fisher公司)。

2 方法

2.1 模型建立 將20只小鼠按隨機數字表法分為對照組和模型組，每組10只，使用來曲唑CMC溶液+高脂乳劑進行造模[8]，連續灌胃21 d，禁食12 h后處死，采用HE染色鏡檢+血清睪酮檢測+體質量監測來確認造模成功與否[9]；對照組僅使用CMC溶液灌胃21 d。所有小鼠造模期間均正常飲水，喂養顆粒飼料。

2.2 含藥血清制備 將20只小鼠隨機分為2組，每組10只，分別灌胃給予70.2 mg/kg桂枝茯苓丸混懸液和等體積生理鹽水，每天2次，連續3 d，最后1次灌胃后1 h麻醉小鼠，腹主動脈采血，常溫靜置4 h，3 000 r/min離心15 min，取血清，0.22 μm微孔濾膜過濾，56 ℃水浴滅活30 min，將滅活后的小鼠空白血清和桂枝茯苓丸含藥血清置于-20 ℃冰箱中保存備用。

2.3 卵巢顆粒細胞分離及培養 將“2.1”項下正常小鼠和PCOS小鼠處死后，于無菌條件下摘除卵巢，PBS沖洗3次，去除周圍脂肪和被膜，用1 mL注射器針頭刺破卵巢卵泡，收集顆粒細胞，0.075 mm篩網過濾，離心后棄上清，加入完全培養基(含100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、10% FBS 的 DMEM/F12培養基)重懸，觀察細胞貼壁情況，待長至90%融合度時消化、收集，用完全培養基重懸，正常小鼠卵巢顆粒細胞和PCOS小鼠卵巢顆粒細胞分瓶培養，隔天換液，用于后續實驗。

2.4 卵巢顆粒細胞分組及給藥 ①為驗證PCOS小鼠卵巢顆粒細胞的自噬水平，明確H19和miR-29b-3p在PCOS小鼠卵巢顆粒細胞中的表達及桂枝茯苓丸含藥血清干預后兩者的變化，將細胞分為對照組、模型組、桂枝茯苓丸含藥血清組，對照組和模型組使用10%空白血清培養72 h；桂枝茯苓丸組使用10%含藥血清培養72 h。②為明確桂枝茯苓丸含藥血清對PCOS小鼠卵巢顆粒細胞自噬的影響，以及調控H19/miR-29b-3p表達對顆粒細胞自噬的影響，將細胞分為模型組、桂枝茯苓丸含藥血清組、桂枝茯苓丸含藥血清+oe-Vector組、桂枝茯苓丸含藥血清+oe-H19組、桂枝茯苓丸含藥血清+inhibitor-NC組、桂枝茯苓丸含藥血清+miR-29b-3p-inhibitor組，模型組使用10%空白血清培養72 h；桂枝茯苓丸含藥血清組使用10%含藥血清培養72 h；桂枝茯苓丸含藥血清+oe-Vector組卵巢顆粒細胞轉染空載質粒后使用10%含藥血清培養72 h；桂枝茯苓丸+oe-H19組卵巢顆粒細胞轉染H19高表達質粒后使用10%含藥血清的培養72 h；桂枝茯苓丸含藥血清+inhibitor-NC組卵巢顆粒細胞轉染inhibitor-NC后使用10%含藥血清培養72 h；桂枝茯苓丸含藥血清+miR-29b-3p-inhibitor組卵巢顆粒細胞轉染miR-29b-3p-inhibitor后使用10%含藥血清培養72 h。

2.5H19基因過表達慢病毒載體構建 針對H19的基因序列，設計特異引物，PCR擴增H19的基因片段，將其插入到慢病毒載體pLVX-EGFP-C1之中，構建重組慢病毒質粒，鑒定測序后將重組慢病毒質粒、pHelper1.0載體質粒和 pHelper 2.0載體質粒共轉染到293 T細胞中，包裝產生慢病毒，并測定滴度。轉染前24 h，將PCOS小鼠卵巢顆粒細胞，以每孔0.5×105個的密度接種至24孔板，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養過夜，將孔內培養基換成0.5 mL Polybrene-培養基混合物，根據感染復數(MOI)值，向每孔內加入20 μL慢病毒，孵育過夜，棄去液體，每孔加入1 mL完全培養基，于培養箱中繼續培養，待細胞長滿后，按照1∶3比例進行傳代，培養48 h后，將培養皿中的細胞培養基換成含200 μg/mL嘌呤霉素篩選培養基，篩選穩定轉導的細胞株。

2.6 miRNA轉染 轉染前1 d，接種適量細胞至6孔板中，當細胞融合度達60%～80%后，開始轉染。使用滅菌ddH2O配制濃度為20 μmol/L的母液；取10 μL miRNA inhibitor加入250 μL OPTI-MEM培養基中，室溫孵育5 min，記為A液；取15 μL RNAiMAX Reagent加入250 μL OPTI-MEM培養基中，室溫孵育5 min，記為B液；將A液與B液輕輕混勻后，超凈臺上靜置20 min?；旌衔镬o置期間，吸棄6孔板中培養基，每孔加入2 mL OPTI-MEM培養基，于培養箱中繼續培養20 min，吸棄培養基，分別將miR-29b-3pinhibitor(100 nmol/L)、miR-29b-3pinhibitor NC(100 nmol/L)與轉染試劑混合物加入6孔板中，再加入1.5 mL細胞培養基，混合均勻，在37 ℃下培養48 h。

2.7 熒光素酶報告基因檢測 構建熒光素酶報告基因質粒pMIR-REPORT-LncRNAH19，利用QuickChange Mutagenesis Kits試劑盒將pMIR-REPORT-LncRNAH19中LncRNAH19與miR-29b-3p的結合位點進行突變。將293 T細胞按50%的密度接種到96孔板內，按照實驗需要分為LncRNAH19-WT+mimics-NC、LncRNAH19-MT+mimics-NC、LncRNAH19-WT+miR-29b-3pmimics、LncRNAH19-MT+miR-29b-3pmimics。配置含有質粒、mimics-NC/miR-29b-3pmimics、Lipofectamine 3000 轉染試劑的混合溶液，室溫靜置20 min，將其加入96孔板中，轉染48 h，使用酶標儀檢測熒光素酶活性。

2.8 檢測指標

2.8.1 小鼠體質量、睪酮水平及卵巢病理形態學檢測 自造模起，每3 d于灌胃前固定時間稱量小鼠體質量，記錄體質量變化。小鼠造模結束后禁食12 h，麻醉后腹腔主動脈采血，室溫靜置2 h，4 ℃、1 500×g離心10 min，取血清，ELISA法檢測睪酮水平。取小鼠卵巢組織，將其制作成石蠟切片，常規脫蠟水化，蘇木素核染，鹽酸乙醇分化，伊紅染液染色，脫水、透明后中性樹膠封片，于相差顯微鏡400倍視野下觀察并拍照。

2.8.2 流式細胞儀檢測卵巢顆粒細胞自噬率 細胞按“2.4”項下方法處理，胰酶消化后重懸細胞，調整細胞密度至1×106/mL，取適量細胞懸液至EP管中，MDC染色，濃度為0.05 mmol/L，37 ℃孵育60 min，PBS清洗后，采用流式細胞儀定量分析其著色熒光強度(488 nm激發波長，檢測30 000個細胞)。

2.8.3 RT-qPCR法檢測LncRNAH19、miR-29b-3pmRNA表達 細胞按“2.4”項下方法處理，收集細胞，LncRNAH19的檢測采用TRIzol法提取細胞總RNA，Nanodrop 2000檢測mRNA濃度，按照逆轉錄反應試劑盒說明書合成cDNA，利用相應引物進行PCR擴增，結果采用 2-ΔΔCT法進行計算。miR-29b-3p的檢測使用miRNA提取試劑盒抽提miRNA，反轉錄反應液配置體系為microRNA 4 μL、4×One step miRNA RT Solution 5 μL、10×miRNA RT Primer 2 μL、RNase Free H2O補至20 μL，利用相應引物進行PCR擴增。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.8.4 Western blot法檢測LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達 細胞按“2.4”項下方法處理后收集，加入RIPA細胞裂解液，BCA法進行蛋白定量，加入5×loading buffer沸水浴10 min，即得蛋白樣品，在-20 ℃下保存備用，進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉移至PVDF膜，加入LC3 Ⅱ/Ⅰ一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入二抗(1∶1 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，使用化學發光試劑顯影，采用Tanon 6600發光成像工作站曝光，Image Pro Plus 6.0軟件對條帶光密度值進行分析，將目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值作為蛋白相對表達量。

3 結果

3.1 PCOS模型建立 與對照組比較，模型組小鼠體質量、血清睪酮水平均升高(P<0.01)，見圖1A～1B。如圖1C所示，對照組小鼠顆粒細胞排列整齊致密，層次較多，卵泡膜細胞層無明顯增厚；模型組小鼠顆粒細胞排列疏松，部分有脫落，層次減少，卵泡膜細胞層增厚，卵巢閉鎖卵泡增加，卵泡的直徑增大，提示造模成功。

3.2 PCOS小鼠卵巢顆粒細胞自噬水平 如圖2A所示，與對照組比較，模型組卵巢顆粒細胞自噬率增加(P<0.01)。如圖2B所示，與對照組比較，模型組卵巢顆粒細胞內LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達升高(P<0.01)。與瞬時LC3Ⅰ、LC3Ⅱ表達比較，一段時間內兩者積聚程度更能體現自噬的改變，因此，2組同時添加10 nmol/L巴佛洛霉素A1對自噬溶酶體降解途徑進行阻斷，結果同樣顯示LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達升高(P<0.01)。

3.3 桂枝茯苓丸含藥血清對卵巢顆粒細胞H19、miR-29b-3pmRNA表達的影響 如圖3所示，與對照組比較，模型組卵巢顆粒細胞中H19 mRNA表達升高(P<0.01)，miR-29b-3pmRNA表達降低(P<0.01)；與模型組比較，桂枝茯苓丸含藥血清組卵巢顆粒細胞中H19、miR-29b-3pmRNA表達發生逆轉(P<0.01)。

3.4H19與miR-29b-3p的靶向關系 如圖4所示，與mimics-NC+LncRNAH19-WT比較，miR-29b-3pmimics+LncRNAH19-WT熒光素酶活性降低(P<0.01)；與miR-29b-3pmimics+LncRNAH19-WT比較，miR-29b-3pmimics+LncRNAH19-MT熒光素酶活性升高(P<0.01)，說明H19和miR-29b-3p有結合位點。

3.5 桂枝茯苓丸含藥血清及調控H19/miR-29b-3p表達對PCOS小鼠卵巢顆粒細胞自噬率的影響 如圖5所示，與模型組比較，桂枝茯苓丸含藥血清組卵巢顆粒細胞自噬率降低(P<0.01)，提示桂枝茯苓丸含藥血清可降低PCOS小鼠卵巢顆粒細胞自噬水平；過表達H19或抑制miR-29b-3p表達后，卵巢顆粒細胞自噬率仍升高(P<0.01)，提示過表達H19或抑制miR-29b-3p的表達均可減弱桂枝茯苓丸對PCOS小鼠顆粒細胞過度自噬的抑制作用。

3.6 桂枝茯苓丸含藥血清及調控H19/miR-29b-3p表達對PCOS小鼠卵巢顆粒細胞LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達的影響 如圖6所示，與模型組比較，桂枝茯苓丸含藥血清組卵巢顆粒細胞LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達降低(P<0.01)，提示桂枝茯苓丸含藥血清可降低PCOS小鼠卵巢顆粒細胞自噬水平；過表達H19或抑制miR-29b-3p表達后，卵巢顆粒細胞LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達仍升高(P<0.01)，提示過表達H19或抑制miR-29b-3p的表達可減弱桂枝茯苓丸對PCOS小鼠顆粒細胞過度自噬的抑制作用。本組實驗同樣添加了10 nmol/L巴佛洛霉素A1對自噬溶酶體降解途徑進行阻斷，以消除其影響，各組結果趨勢與未添加巴佛洛霉素A1一致。

4 討論

流行病學調查顯示，近年來PCOS發病率呈逐年上升的趨勢，我國育齡期女性患病率為5.6%[10]，PCOS患者約占不孕人群的1/3[11]。盡管對PCOS的研究開展多年，其病因和發病機制仍然不明確，也缺乏針對性的治療藥物和手段。越來越多證據表明，非編碼RNA和自噬與PCOS發病過程密切相關[12-13]，非編碼RNA可通過調節細胞自噬，影響多種疾病發生發展[14]，但目前在關于PCOS的研究中，并未見報道。中醫學認為PCOS屬于“不孕”“癥瘕”“閉經”范疇，“痰濕瘀血”是其主要病機[15]。桂枝茯苓丸的君藥桂枝溫通行瘀滯；臣藥桃仁助君祛瘀；佐藥丹皮、芍藥活血散瘀，茯苓滲濕利濁，全方共奏化痰利水、活血化瘀之功，契合PCOS痰濕瘀血之病機。

非編碼RNA是指不翻譯蛋白的RNA，其中包括LncRNA和miRNA，可在多個水平調控基因表達和蛋白質功能。近年來研究發現，非編碼RNA在PCOS中應用潛力巨大，多種非編碼RNA在PCOS患者或動物模型的血清、卵泡液、顆粒細胞中均有不同程度的差異表達，可作為特異性的診斷和治療靶點[12]。H19是第一個被發現的LncRNA，研究人員發現在PCOS患者的血液、卵巢顆粒細胞中，H19表達升高，認為其可作為生物學標志物為PCOS的診斷提供參考[16-17]。LncRNA最常見的調節機制是作為競爭性內源性RNA與miRNA 相結合調控下游靶基因的表達[18]。王滟等[19]在卵巢癌細胞中發現，H19表達上調，miR-29b-3p表達下調，H19可靶向下調miR-29b-3p促進人卵巢癌細胞增殖、侵襲和轉移。本研究證實，在PCOS小鼠卵巢顆粒細胞中H19表達升高，miR-29b-3p表達降低，使用桂枝茯苓丸含藥血清干預后，顆粒細胞中H19、miR-29b-3p表達發生了逆轉，熒光素酶報告基因檢測顯示H19與miR-29b-3p有結合位點，故推測桂枝茯苓丸可能通過調節H19/miR-29b-3p表達起到治療PCOS的作用。

多項研究表明，PCOS卵巢顆粒細胞自噬異常激活，過度自噬會引起細胞結構的破環，影響卵細胞正常發育，導致排卵障礙和性激素合成失調[20-21]，通過改變顆粒細胞自噬水平有望成為治療PCOS的新方法。自噬受多種信號分子調節，研究表明非編碼RNA可通過參與自噬調控網絡，介導自噬相關基因的轉錄和轉錄后調控[22]。H19和miR-29b-3p曾被證實在多種腫瘤疾病中參與對自噬的調控，H19在肝癌細胞中高表達，敲除H19后，可下調自噬小泡及LC3Ⅱ/Ⅰ的比值，增加細胞活性[23]；在胃癌細胞中miR-29b-3p表達降低，過表達miR-29b-3p可下調其靶基因，從而調節自噬[24]，因此，H19/miR-29b-3p很可能是調節自噬的關鍵基因靶點。本研究發現，PCOS小鼠卵巢顆粒細胞自噬水平升高，與既往研究相一致，桂枝茯苓丸含藥血清可降低其自噬水平，而過表達H19或抑制miR-29b-3p表達，則減弱了桂枝茯苓丸對PCOS小鼠顆粒細胞過度自噬的抑制作用，說明H19/miR-29b-3p參與調控PCOS小鼠卵巢顆粒細胞自噬。

綜上所述，桂枝茯苓丸含藥血清可通過調控H19/miR-29b-3p途徑，抑制PCOS小鼠卵巢顆粒細胞自噬水平，對卵巢顆粒細胞起保護作用，為桂枝茯苓丸防治PCOS提供了新的思路和方法。