miR-762與sTREM-1 sFLT-1在急性肺損傷中的相關(guān)性研究

宋 洋， 賀曉楠

(1.北京老年醫(yī)院， 北京 1000952.首都醫(yī)科大學(xué)， 北京 100095)

急性肺損傷(Acute lung injury，ALI)是危重病患者發(fā)病、死亡的重要原因，占所有重癥監(jiān)護(hù)室總?cè)藬?shù)的10%以上，占所有住院人數(shù)的4%[1,2]。據(jù)報道，部分群體ALI的死亡率達(dá)到60%，總體死亡率已至40%[3]。ALI已被重新分類，列為輕度或中度急性呼吸窘迫綜合征。大部分ALI患者起初僅有短期的呼吸困難，最終發(fā)展成難治性呼吸衰竭[4]。因此早期診斷ALI十分重要。雖然病理生理學(xué)方面的最新進(jìn)展不斷發(fā)現(xiàn)與臨床預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物，但是仍缺乏在臨床上診斷效果的評價。微小RNA(miRNA)是一種內(nèi)源性保守的短鏈非編碼單鏈RNA，能夠通過與靶基因的結(jié)合抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄過程，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的翻譯，參與人類幾乎所有疾病的發(fā)生過程[5]。miR-762是近幾年新發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，其參與多種癌癥的惡化、腎臟損傷、肺損傷、心肌梗死等[6～8]。但是，miR-762在ALI患者的病情發(fā)展過程中的變化是否具有臨床預(yù)測價值尚未有人研究。可溶性髓系細(xì)胞觸發(fā)受體-1(Soluble myeloid cell trigger receptor-1，sTREM-1)、可溶性FMS樣酪氨酸激酶1(Soluble FMS like tyrosine kinase 1，sFlt-1)是最近2年研究比較多的預(yù)測肺炎病情進(jìn)展的生物標(biāo)記物[8,9]。因此，此研究假設(shè)ALI患者中的miR-762與sTREM-1、sFlt-1存在一定的關(guān)聯(lián)。本研究旨在探究miR-762在ALI患者血漿中與sTREM-1、sFlt-1之間的聯(lián)系。

1 資料與方法

1.1一般資料:樣本來自本醫(yī)院2018年9月至2021年9月期間接診的肺損傷患者60例，其中急性危重患者30例，輕癥患者30例。同時采取同時期接受體檢的健康血樣30例。所有受試者或家屬都知曉此事并簽署同意書。mMRC評分表示肺損傷的程度，0、Ⅰ、Ⅱ級為中低度損傷患者；Ⅲ、Ⅳ級為重度損傷患者。醫(yī)院確診肺損傷的患者(輕度呼吸困難、中度呼吸困難和重度呼吸困難)次日到醫(yī)院采血站空腹采集靜脈血5mL。所有研究對象的血樣均放置在-80℃保存，備用。人可溶性髓系細(xì)胞觸發(fā)受體-1(sTREM-1)檢測試劑盒、人可溶性FMS樣酪氨酸激酶1(sFlt-1)檢測試劑盒均購自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；血漿microRNA提取試劑盒購自杭州昊鑫生物科技股份有限公司；miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒購自北京賽爾瑞成生物公司；miRNA熒光定量試劑盒購自北京天根生物。實(shí)驗(yàn)所用引物的設(shè)計、合成均由上海吉瑪生物完成。

1.2方 法

1.2.1患者APACHEⅡ評分:急性生理學(xué)及慢性健康狀況(Acute physiology and chronic health evaluation，APACHEⅡ)評分系統(tǒng)對研究對象進(jìn)行評分，觀察各組研究對象的得分情況。

1.2.2ELISA檢測血漿sTREM-1、sFLT-1的含量:取出待檢測的血漿，嚴(yán)格按照人可溶性髓系細(xì)胞觸發(fā)受體-1(sTREM-1)檢測試劑盒、人可溶性FMS樣酪氨酸激酶1(sFlt-1)檢測試劑盒要求操作，檢測血漿中sTREM-1、sFLT-1的含量。

1.2.3RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測血漿miR-762表達(dá):將待檢測的血漿用血漿microRNA提取試劑盒提取所有miRNA，再用miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒將其合成cDNA，最后用miRNA熒光定量試劑盒檢測其中miR-762的表達(dá)。以U6作為內(nèi)參，2-△△Ct法計算miR-762的相對表達(dá)水平。采用總體積20 μL的反應(yīng)體系，加10 μL模板，上下游引物各2 μL，雙蒸水補(bǔ)齊。反應(yīng)程序?yàn)?5℃反應(yīng)2min，95℃反應(yīng)20s，再60℃退火反應(yīng)30s，72℃反應(yīng)40s，進(jìn)行42個循環(huán)。miR-762上游引物為ACACGGGGCUGGGGCCGGGGCCGAGCGCCTC，下游引物為CTCAGGGGCUGGGGCCGGGGCCGAGCCAGA；U6為通用引物。每個樣本重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1不同程度肺損傷患者的APACHEⅡ評分:與正常組相比，中低危組和高危組患者APACHEⅡ評分均顯著升高，與中低危組相比，高危組患者APACHEⅡ評分也顯著升高(P<0.05)，見表1。

表1 肺損傷患者的APACHEⅡ評分情況

表2 sTREM-1 sFLT-1在肺損傷患者血漿中的含量

2.2sTREM-1、sFLT-1在不同程度肺損傷患者血漿中的表達(dá):與正常組相比，中低危組和高危組患者血漿中sTREM-1、sFLT-1的含量均顯著升高，與中低危組相比，高危組患者血漿中sTREM-1、sFLT-1的含量也顯著升高(P<0.05)，見表2。

2.3miR-762在不同程度肺損傷患者血漿中的表達(dá):與正常組相比，中低危組和高危組患者血漿中miR-762的相對表達(dá)量均顯著升高，與中低危組相比，高危組患者血漿中miR-762的相對表達(dá)量也顯著升高(P<0.05)，見表3。

表3 miR-762在肺損傷患者血漿中的相對表達(dá)量

2.4血漿miR-762含量預(yù)測不同程度肺損傷的診斷價值:通過繪制ROC曲線，顯示血漿miR-762相對表達(dá)量預(yù)測中低危、高危肺損傷患者的曲線下面積(Area under curve，AUC)為0.987，95% 置信區(qū)間為0.9688～1.000，如圖1所示。

圖1 中低危、高危肺損傷患者血漿miR-762的ROC曲線

2.5miR-762與APACHEⅡ評分及sTREM-1、sFLT-1表達(dá)水平的相關(guān)性分析:結(jié)果如圖2所示，血漿中miR-762的相對表達(dá)量與APACHEⅡ評分及sTREM-1、sFLT-1的相關(guān)系數(shù)r分別為0.386、0.321、0.432，均呈正相關(guān)，95% CI分別為0.124～0.493、0.2450～0.586、0.197～0.548。

圖2 血漿miR-762相對表達(dá)量與APACHEⅡ評分及sTREM-1、sFLT-1的相關(guān)性分析

3 討 論

miRNA參與調(diào)控肺損傷的整個發(fā)生、發(fā)展過程已經(jīng)得到很多研究的證實(shí)。最近不斷有研究發(fā)現(xiàn)調(diào)控ALI的新miRNA，如miR-26a-5p能夠通過靶向結(jié)締組織生長因子CTGF減輕脂多糖誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和凋亡，miR-499-5p能夠減輕膿毒癥肺損傷小鼠肺組織細(xì)胞的凋亡并抑制炎癥反應(yīng)，miR-92a作為藥物注入ALI小鼠肺部具有明顯的抗炎抗凋亡功效[10,11]。miR-762在ALI中的功能也是近兩年才被發(fā)現(xiàn)的，目前，miR-762在肺損傷中的作用及診斷價值仍在繼續(xù)開發(fā)。miR-762在ALI患者、ALI模型小鼠和脂多糖誘導(dǎo)的A549細(xì)胞中的表達(dá)均升高，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，而miR-762拮抗劑可顯著降低LPS處理的小鼠的炎癥和ALI損傷，miR-762模擬物可加重小鼠的炎癥和ALI損傷。本研究推斷miR-762與肺損傷患者的病情進(jìn)展緊密相關(guān)，其表達(dá)量可能具有一定的臨床診斷意義。本研究結(jié)果顯示，APACHEⅡ評分、miR-762的表達(dá)量隨患者肺損傷的嚴(yán)重程度而逐漸升高，且miR-762作為診斷中低危患者和高危患者的肺損傷標(biāo)志物具有較高的價值(AUC=0.987)，揭示了miR-762在肺損傷的臨床診斷、治療中的潛在作用。

TREM-1是單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞上的細(xì)胞表面受體，其通過激活TREM-1-自然殺傷激活受體相關(guān)蛋白(DAP12)信號通路促進(jìn)促炎細(xì)胞因子或炎癥趨化因子的分泌。可溶性TREM-1(sTREM-1)是TREM-1的一種特殊形式，可在人體體液中直接檢測，也是傳染病學(xué)中著名的生物標(biāo)志物。sTREM-1水平可能會用于某些疾病的早期診斷、預(yù)后的預(yù)測，如ALI損傷。FMS樣酪氨酸激酶1(FLT-1)是Ⅲ型受體酪氨酸激酶的一種糖蛋白,普遍存在于人體的血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)，sFLT-1為其中一種。近些年，sFLT-1常作為血管生成抑制劑在臨床上發(fā)揮作用。血漿中sFLT-1的異常升高及定量表達(dá)與患者肺部的損傷及感染狀況緊密相關(guān)，肺炎患者血漿中sTREM-1、sFLT-1的含量顯著升高并且可作為重癥肺炎患者病情監(jiān)察的指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)sTREM-1、sFLT-1的含量與患者的APACHEⅡ評分呈正相關(guān)，這均與前文的研究中的結(jié)果相一致。進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，血漿中miR-762的表達(dá)量與APACHEⅡ評分和sTREM-1、sFLT-1均呈正相關(guān)性，miR-762與在肺損傷過程中的作用也許可能與促進(jìn)sTREM-1、sFLT-1的表達(dá)存在某種聯(lián)系。由于本研究存在樣本的地域限制和樣本量的限制，可能存在不同地域或不同人種的肺損傷患者血漿中miR-762表達(dá)量的差異，因此，本研究得到的預(yù)測肺損傷患者病情的血漿miR-762截斷值可能存在局限性。本實(shí)驗(yàn)室下一步將擴(kuò)大樣本納入的范圍和數(shù)量，探究miR-762在肺損傷中的功能與sTREM-1、sFLT-1之間的潛在關(guān)系。

綜上所述，急性肺損傷患者中miR-762高表達(dá)，并與sTREM-1、sFLT-1的表達(dá)水平呈正相關(guān)，可作為預(yù)測急性肺損傷患者病情進(jìn)展的生物標(biāo)志物。