miR-106b介導RANKL/RANK/OPG通路抗骨質疏松癥的實驗研究

王正君， 白馬恒

(1.陜西省榆林市急救指揮調度中心業務科, 陜西 榆林 7190002.陜西省榆林市星元醫院骨科， 陜西 榆林 719000)

骨質疏松癥是一種常見全身性骨骼疾病，多發于老年人群，其特征包括骨量減少、骨脆性增加、骨組織結構退化等[1]。在我國，骨質疏松癥發病率呈逐年上升趨勢，在常見病中位居第5[2]。近年基于微小核糖核酸(miRNA)的靶向基因療法在骨骼相關疾病中顯示出良好的開發前景。miR-106b可調節骨髓間充質干細胞的成骨分化，在骨骼代謝中發揮重要作用。既往研究證實[3]，核因子κB受體激活因子配體(RANKL)/核因子κB受體激活因子(RANK)/骨保護素(OPG)信號通路可調節骨吸收與骨生成的平衡，且此通路的異常激活與骨質疏松癥的發生密切相關。據研究報道[4]，miR-106b可通過下調軟骨細胞丙酮酸脫氫酶激酶(PDK4)表達，影響RANKL/RANK/OPG通路，但其是否可直接調控RANKL/RANK/OPG通路抗骨質疏松癥尚不明確。本研究通過建立骨質疏松癥大鼠模型，探討miR-106b介導RANKL/RANK/OPG通路對骨質疏松癥的治療作用和可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物和細胞：Wistar雌性大鼠70只，6月齡，體質量(280±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2016-0011]。遵循減少、替代和優化原則設計實驗。人胚腎細胞293T細胞購自中科院上海細胞庫。

1.2主要試劑和儀器：miR-106b mimics-NC、miR-106b mimics、miR-106b inhibitor-NC和miR-106b inhibitor均由廣州銳博生物科技有限公司設計并合成；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司(貨號：15596026)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司(貨號：G1120)；兔抗鼠RANKL、RANK、OPG、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體，二抗均購自美國Thermo Fisher公司(貨號：PA5-110268，PA5-80144，PA5-86053，PA1-16777；31460，G-21234，65-6120，32460)；雙熒光素酶報告基因試劑盒購自美國Promega公司(貨號：E1910)；RAD SPEED-M型X線機購自日本株式會社島津制作所；Axio Imager 2光學顯微鏡購自北京普瑞賽司儀器有限公司；JC-TG-16R臺式離心機購自青島聚創環保集團有限公司；C1000 Touch熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)儀購自美國Bio-Rad公司；Mini-PROTEAN?蛋白電泳儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3方 法

1.3.1建模、分組和轉染:取60只Wistar大鼠，腹腔注射40mg/kg戊巴比妥鈉致其麻醉。沿大鼠腰背椎側正中切口，切除雙側卵巢；另10只大鼠僅切除卵巢旁脂肪組織作為假手術組[5]。正常飼養8周后，造模大鼠陰道涂片檢查未見成熟脫落上皮細胞，且無規律動情變化，X線片顯示股骨骨質變薄，骨紋理稀疏，提示骨質疏松癥大鼠模型建立成功。51只大鼠建模成功，成功率85%。建模成功的大鼠隨機分為模型組(11只)、miR-106b mimics-NC組(10只)、miR-106b mimics組(10只)、miR-106b inhibitor-NC組(10只)、miR-106b inhibitor組(10只)。除模型組外其余各組分別轉染miR-106b模擬物陰性對照、miR-106b模擬物、miR-106b抑制劑陰性對照和miR-106b抑制劑，具體轉染方法：建模成功7d后向大鼠皮下注射對應的200μL含轉染試劑的核酸溶液，每周1次，連續4周。

1.3.2X線骨密度儀檢測大鼠股骨骨密度:采用雙能X線骨密度儀，掃描大鼠兩側股骨，測骨密度。

1.3.3HE染色觀察大鼠右側股骨組織病理學變化:頸椎脫臼法處死大鼠，分離大鼠右側股骨組織，常規固定、脫水、包埋、切片、脫蠟，蘇木素、伊紅依次染色，脫水、透明、封片，光鏡下觀察病理學變化。

1.3.4實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測大鼠右側股骨組織miR-106b表達、RANKL、RANK、OPG信使核糖核酸(mRNA)表達:取大鼠右側股骨組織，Trizol法提取總RNA。逆轉錄得到互補脫氧核糖核酸(cDNA)，反應體系20μL。反應程序：94℃ 5min，94℃ 45s，60℃ 30s，72℃ 45s，45個循環。miR-106b檢測以U6為內參，RANKL、RANK和OPG檢測以GAPDH為內參。2-△△Ct法計算各基因相對表達量。引物序列見表1。

1.3.5免疫印跡(WB)檢測大鼠右側股骨組織RANKL、RANK、OPG蛋白表達:取大鼠右側股骨組織，提取總蛋白，蛋白變性，上樣電泳，轉膜，封閉，加一抗4℃孵育過夜，洗膜，加二抗室溫孵育1h，洗膜，電化學發光液顯影。Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內參計算目的蛋白相對表達量。

1.3.6雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-106b和RANKL的靶向關系:Target scan網站預測miR-106b和RANKL的結合位點，構建插入野生型(WT)、突變型(Mut)RANKL的雙熒光素酶報告質粒，將報告質粒與miR-106b mimics或miR-106b mimics-NC共轉染至293T細胞，雙熒光素酶報告基因實驗檢測試劑盒測內參基因、報告基因發光值。

表1 引物序列

2 結 果

2.1各組大鼠股骨骨密度:轉染期間各組大鼠均未發現排異反應。與假手術組比，模型組股骨骨密度降低(P<0.05)；與miR-106b mimics組比，模型組、miR-106b mimics-NC組股骨骨密度下降(P<0.05)；與模型組、miR-106b inhibitor-NC組比，miR-106b inhibitor組股骨骨密度降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠股骨骨密度比較

2.2各組大鼠右側股骨組織病理學變化:假手術組骨小梁排列緊密、厚度均勻。模型組、miR106b mimics-NC組、miR106b inhibitor-NC組骨細胞數明顯減少，骨小梁間隙較大，排列紊亂。miR106b mimics組骨細胞數明顯增多，排列較緊密，骨小梁厚度增加。miR106b inhibitor組骨細胞數缺失，骨小梁間隙極大，排列紊亂。見圖1。

圖1 大鼠右側股骨組織HE染色(×200)

2.3各組大鼠右側股骨組織miR-106b表達、RANKL、RANK、OPG mRNA表達:與假手術組比，模型組右側股骨組織RANKL mRNA表達升高(P<0.05)，miR-106b表達和OPG mRNA表達降低(P<0.05)；與模型組、miR-106b mimics-NC組比，miR-106b mimics組右側股骨組織RANKL mRNA表達降低(P<0.05)，miR-106b表達和OPG mRNA表達升高(P<0.05)；與模型組、miR-106b inhibitor-NC組比，miR-106b inhibitor組右側股骨組織RANKL mRNA表達升高(P<0.05)，miR-106b表達和OPGmRNA表達降低(P<0.05)；各組大鼠右側股骨組織RANK mRNA表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組大鼠右側股骨組織RANKL RANK OPG mRNA表達

2.4各組大鼠右側股骨組織RANKL、RANK、OPG蛋白表達:與假手術組比，模型組右側股骨組織RANKL蛋白表達升高(P<0.05)，OPG蛋白表達降低(P<0.05)；與模型組、miR-106b mimics-NC組對比，miR-106b mimics組右側股骨組織RANKL蛋白表達降低(P<0.05)，OPG蛋白表達升高(P<0.05)；與模型組、miR-106b inhibitor-NC組比，miR-106b inhibitor組右側股骨組織RANKL蛋白表達升高(P<0.05)，OPG蛋白表達降低(P<0.05)；各組大鼠右側股骨組織RANK蛋白表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 各組大鼠右側股骨組織RANKL RANK OPG蛋白表達

2.5雙熒光素酶報告基因驗證miR-106b和RANKL靶向關系:Target scan網站預測結果顯示，miR-106b可以結合RANKL的3'-UTR區域，見圖2A。在轉染野生型RANKL細胞中，miR-106b mimics組細胞相對熒光強度低于miR-106b mimics-NC組細胞，差異有統計學意義(P<0.05)；在轉染突變型RANKL細胞中，miR-106b mimics組和miR-106b mimics-NC組細胞相對熒光強度差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2B。

圖2 A miR-106b和RANKL靶向關系；B雙熒光素酶報告基因實驗驗證結果

與miR-106b mimics-NC組比，*P<0.05

3 討 論

骨質疏松癥的發生涉及年齡、遺傳因素、性別、女性絕經、激素、生活方式及營養狀態等因素[6]。正常的骨代謝依賴于骨重建平衡，骨吸收增加或骨形成減少均引起骨量丟失、骨強度不足，進而導致骨質疏松癥的發生[7]。因此，研究骨質疏松癥的新靶點、新療法具有重要意義。

miRNA可在轉錄后水平調控基因的表達，參與多種生理、病理過程[8]。Ménard C等[9]研究發現，miR-106b可抑制病理性視網膜血管生成。Yu B等[10]研究表明，抑制miR-106b表達可抑制磨損碎片誘導的大鼠假體周圍骨溶解的炎性骨破壞。本研究建立骨質疏松癥大鼠模型，為觀察miR-106b過表達、miR-106b低表達對骨質疏松的影響設置miR-106b mimics組、miR-106b inhibitor組，同時為避免干擾因素的影響另設置miR-106b mimics-NC組、miR-106b inhibitor-NC組；各組轉染后發現miR-106b mimics組miR-106b表達最高，假手術組miR-106b表達次之，模型組、miR-106b mimics-NC組、miR-106b inhibitor-NC組表達稍低，miR-106b inhibitor組表達最低，證實轉染成功；miR-106b mimics組大鼠股骨骨密度升高，骨細胞數增多，排列緊密，骨小梁厚度增加；miR-106b inhibitor組大鼠股骨骨密度降低，骨細胞數缺失，排列紊亂，骨小梁間隙較大，提示miR-106b可增加骨質疏松癥大鼠股骨骨密度，減輕右側股骨組織病理損傷。

RANKL是破骨前體細胞分化、成熟的必需因子，可增強破骨細胞活性，抑制破骨細胞凋亡[11]。OPG是調節骨代謝的關鍵因子。RANKL通過與破骨前體細胞、破骨細胞膜受體RANK結合，發揮加快骨質吸收、溶解的作用；同時，成骨細胞分泌OPG，與RANK競爭性結合RANKL，抑制破骨前體細胞分化、成熟，降低破骨細胞活性，調節骨吸收與骨形成間的平衡[12]。Wang X等[13]研究表明，香葉甲素可通過調節RANKL/RANK/OPG信號通路對糖皮質激素誘導的骨質疏松癥大鼠發揮骨保護作用。本研究結果顯示，miR-106b mimics組大鼠右側股骨組織RANKL mRNA、蛋白表達降低，OPG mRNA、蛋白表達升高；miR-106b inhibitor組大鼠右側股骨組織RANKL mRNA、蛋白表達降低，OPG mRNA、蛋白表達升高；雙熒光素酶報告基因結果顯示miR-106b直接靶向RANKL。上述結果提示miR-106b可靶向調控RANKL的表達，從而抑制RANKL/RANK/OPG信號通路。而關于miR-106b靶向RANKL通路影響成骨細胞增殖和分化的結論已有文獻資料報道[14]證實，本研究結果與上述報道一致，再次證實miR-106b可直接靶向RANKL從而可以防治骨質疏松癥。

綜上所述，上調miR-106b表達可增加骨質疏松癥大鼠股骨骨密度，減輕右側股骨組織病理損傷，可能與抑制RANKL表達，促進OPG表達有關，為骨質疏松癥的臨床治療研究提供了新思路。