白蘆藜醇對大鼠牙移植后牙周組織愈合及Sirt1/Nrf2信號通路的影響

王 鵬， 陳 慧， 代喆穎， 江 鈴， 彭 紅， 周 輝

(湖北省武漢市第三醫院口腔科， 湖北 武漢 430060)

牙齒缺失的治療是一項非常具有挑戰性的工作，種植體修復體已被廣泛用于替換缺失的牙齒[1]。然而，種植體假體存在多個缺點，如缺乏生理本體感覺和牙周韌帶(periodontal ligament，PDL)對咀嚼的感覺反應缺失[2]。最近的研究顯示，牙齒自體移植，可以將非功能性牙齒(通常是第三磨牙)轉移到功能性位置，具有較高的成功率[3,4]。白蘆藜醇(Resveratrol，RSV)是一種天然存在的植物抗生素，可從多種植物如葡萄等物質中獲取。由于其生物學效應，被認為是治療各種慢性疾病的潛在候選藥物[5]。據報道，RSV可通過減少破骨細胞的形成和促進成骨細胞的形成來影響骨代謝[6]。故而，推測RSV可能通過影響成骨細胞和破骨細胞來改變牙移植后牙周組織愈合。此外，RSV在多項研究中被用作Sirt1信號通路的激活劑發揮作用[7]，且Nrf2已被證實是Sirt1的下游靶基因[8]。因此，推測RSV對牙移植后牙周組織愈合的影響可能與Sirt1/Nrf2信號通路有關。

1 材料與方法

1.1實驗動物：48只SPF級雄性Lewis大鼠，8周齡，體重(180±15)g購自中國科學院動物研究所[許可證號SCXK(京)2021-0012]；飼養條件為標準的12h明暗循環，恒溫約25℃，自由飲食和水。實驗方案經武漢市第三醫院醫學倫理委員會審核批準。

1.2藥物與試劑：RSV粉劑購自美國Sigma Aldrich公司(批號：R5010，純度≥99%)；羧甲基纖維素(Carboxymethyl cellulose，CMC)溶液購自北京YITA公司(批號：SY0248)；HE染色液購自北京Leagene公司(批號：DH0006)；抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)染色試劑盒購自美國Sigma公司(批號：387-1KT)；小鼠源一抗核因子κB受體激活劑配體(Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand，RANKL，批號：ab239607)、Sirt1(批號：ab110304)、β-actin(批號：ab8226)和兔源一抗骨保護素(Osteoprotegerin，OPG，批號：ab73400)、Runt相關轉錄因子2(Runt-related transcription factor 2，RUNX2，批號：ab236639)、骨鈣素(Osteocalcin，OCN，批號：ab93876)、Nrf2(批號：ab92946)均購自英國Abcam公司。

1.3主要儀器：BX51光學顯微鏡(日本Olympus公司)；SU8010型掃描電子顯微鏡(日本HITACHI公司)；OmegaLum C型凝膠成像系統(美國Aplegen公司)。

1.4方 法

1.4.1大鼠牙移植模型構建及處理：將大鼠按照隨機數字表法分為4組(每組12只)：依次為對照(Control)組、模型(Model)組、低劑量RSV(L-RSV)組和高劑量RSV(H-RSV)組。Control組不作處理，其余組均將大鼠右上頜第一磨牙植入大鼠右上頜第一磨牙牙槽窩[9]。14d后，Control組和Model組大鼠每天早上8點整灌胃等量CMC，L-RSV組和H-RSV組大鼠分別給予5mg·kg-1·d-1RSV或10mg·kg-1·d-1RSV(溶于CMC)灌胃[10]，每天一次。大鼠牙移植后28d，所有大鼠均以過量麻醉藥物處死。每組分為2個亞組，其中一個亞組分別用HE染色、TRAP染色和免疫組化染色觀察牙周組織病理學和成骨分化相關因子的變化。第二個亞組通過掃描電子顯微鏡分析牙根吸收面積的比例和Sirt1/Nrf2信號通路相關蛋白水平。

1.4.2標本制備和染色：大鼠上頜骨在4℃下于4%多聚甲醛中固定24h，在10% EDTA中脫鈣至少2個月。將脫水的樣本包埋在石蠟中，切成5 μm厚的切片。行常規HE染色，觀察牙周組織病理學變化。使用TRAP染色試劑盒鑒定破骨細胞[11]，計算TRAP陽性細胞數。對于免疫組化染色，先用消化酶回收抗原，而后將載玻片在4℃下與一抗孵育90min，分別以1∶300(RANKL和OCN)、1∶400(RUNX2)和1∶50(OPG)的濃度稀釋抗體，相應的二抗孵育后，光學顯微鏡下觀察RANKL、OCN、RUNX2和OPG的陽性表達。

1.4.3掃描電子顯微鏡觀察牙根吸收情況：將上頜骨浸泡在10%次氯酸鈉溶液中數小時。首先仔細拔除磨牙，輕輕去除牙齒周圍的牙周膜，然后去掉除2個遠中根外的其他3個牙根。掃描電子顯微鏡觀察遠中根的近側，用Image J軟件計算牙根吸收面積與總表面積比(即牙根吸收率)。

1.4.4Western blot檢測牙周組織中Sirt1、Nrf2蛋白水平：將1.4.3中取出的牙周組織通過RIPA法提取總蛋白，并通過電泳分離。將分離的蛋白轉移到PVDF膜上，用5%的脫脂牛奶封閉后，在4℃下與一抗過夜孵育，均以1∶1000(Sirt1、Nrf2、β-actin)的比例稀釋抗體。相應的二抗室溫孵育2h后，使用ECL試劑盒結合OmegaLum C型凝膠成像系統檢測，并通過Image J軟件量化。

2 結 果

2.1RSV對大鼠牙移植后牙周組織病理學的影響：Control組牙周組織形態正常，Model組牙周組織破壞最明顯，牙槽骨表面可見大量破骨細胞，炎癥細胞大量浸潤；且牙根表面多見局部牙根吸收，牙根吸收陷窩最大、最深。L-RSV組和H-RSV組牙周組織損傷程度和牙根吸收面積均小于Model組；且L-RSV組牙周損傷程度和牙根吸收面積大于H-RSV組。見圖1。

圖1 各組大鼠牙移植后牙周組織病理情況(HE染色，×200)

圖2 各組大鼠牙移植后牙周組織中破骨細胞數量(TRAP染色，×200)

2.2RSV對大鼠牙移植后破骨細胞的影響：與Control組比較，Model組大鼠牙周組織中TRAP陽性破骨細胞數量增多(P<0.05)；與Model組比較，L-RSV組、H-RSV組大鼠牙周組織中TRAP陽性破骨細胞數量均降低(P<0.05)；與L-RSV組比較，H-RSV組大鼠牙周組織中TRAP陽性破骨細胞數量均降低(P<0.05)。見圖2、表1。

2.3RSV對大鼠牙移植后牙周組織中RANKL、OPG、RUNX2和OCN表達的影響：與Control組比較，Model組RANKL水平升高，OPG、RUNX2和OCN水平降低(P<0.05)；與Model組比較，L-RSV組、H-RSV組RANKL水平降低，OPG、RUNX2和OCN水平升高(P<0.05)；與L-RSV組比較，、H-RSV組RANKL水平降低，OPG、RUNX2和OCN水平升高(P<0.05)。見圖3、表2。

表1 RSV對大鼠牙移植后破骨細胞的影響

表2 RSV對大鼠牙移植后牙周組織中RANKL OPG RUNX2和OCN表達的影響

圖3 免疫組化檢測各組大鼠牙周組織中RANKL、OPG、RUNX2和OCN表達情況

2.4 RSV對大鼠牙移植后牙根吸收的影響：與Control組比較，Model組大鼠牙周組織中牙根吸收率升高(P<0.05)；與Model組比較，L-RSV組、H-RSV組大鼠牙周組織中牙根吸收率均降低(P<0.05)；與L-RSV組比較，H-RSV組大鼠牙周組織中牙根吸收率均降低(P<0.05)。見圖4、表3。

表3 RSV對大鼠牙移植后破骨細胞的影響

2.5RSV對大鼠牙移植后牙周組織中Sirt1/Nrf2信號通路的影響：與Control組比較，Model組Sirt1、Nrf2蛋白水平降低(P<0.05)；與Model組比較，L-RSV組、H-RSV組Sirt1、Nrf2蛋白水平升高(P<0.05)；與L-RSV組比較，H-RSV組Sirt1、Nrf2蛋白水平升高(P<0.05)。見圖5、表4。

圖5 Western blot檢測Sirt1、Nrf2蛋白水平

表4 RSV對大鼠牙移植后Sirt1 Nrf2蛋白水平的影響

3 討 論

RSV是一種天然合成的植物化學物質，即使在高濃度下也不會產生有害作用，因此可以作為膳食補充劑。據報道，RSV對破骨細胞的骨吸收有抑制作用，也有對成骨細胞骨形成的促進作用[6]，這與牙移植過程中牙周組織愈合過程密切相關。然而，到目前為止，關于RSV與牙移植后牙周組織愈合的相關數據在文獻中很少見。

TRAP為破骨細胞和骨吸收的關鍵標志物。本研究使用TRAP染色來檢查牙移植后牙周組織中破骨細胞的數量。結果顯示，RSV處理根部和牙槽骨周圍TRAP陽性細胞數量明顯少于Model組，表明RSV在抑制破骨細胞形成中具有重要作用。據報道，成骨細胞表達的RANKL是破骨細胞生成的關鍵調節因子之一。而OPG可阻止RANKL與其細胞表面受體RANK結合進而對破骨細胞分化具有抑制作用[12]。本研究結果顯示，Model組牙周組織中RANKL上調，OPG下調，而用RSV處理后這種表達得到逆轉。表明RANKL/RANK/OPG系統很有可能是RSV在大鼠牙移植后牙周組織愈合的直接機制。RUNX2是骨形成的關鍵激活劑和早期成骨分化的標志物，OCN是成骨細胞成熟的標志。在本研究中，RUNX2和OCN在大鼠牙移植模型中的表達降低，而RSV可明顯上調二者表達。此外，本研究還證實了RSV可改善大鼠牙移植后牙周組織的損傷程度，同時還可明顯抑制牙根吸收率。以上數據證實，RSV可能通過抗破骨細胞形成、促成骨形成以及抑制牙根吸收等方面在牙移植后牙周組織的愈合過程中發揮重要保護作用。

RSV已被證實是Sirt1強效激活劑[7]，Nrf2是Sirt1的下游靶基因[8]。據報道，RSV通過激活Sirt1/Nrf2信號通路抑制活性氧產生和成纖維樣滑膜細胞增殖進而改善類風濕關節炎[13]。近期研究顯示，RSV通過Sirt1/Nrf2通路減少氧化應激增強人牙髓基質細胞成骨潛能[14]。本研究結果證實，牙移植后牙周組織中Sirt1、Nrf2蛋白水平均明顯降低，而RSV干預可明顯上調Sirt1、Nrf2蛋白水平。結合以往研究得出，RSV可能通過激活Sirt1/Nrf2通路介導大鼠牙移植后牙周組織愈合。

綜上所述，RSV可改善牙移植后牙周組織損傷，可能與激活Sirt1/Nrf2通路，調控破骨細胞、成骨細胞的形成有關。有研究表明，RSV在正常大鼠體內應用不會導致骨骼發生明顯變化[15]，但由于RSV濃度不同、實驗時期不同、大鼠病情不同，不能否認全身應用RSV可能會產生影響。