芒柄花苷經(jīng)AMPK/SIRT1/FoxO1通路對2型糖尿病腎病大鼠腎損傷的改善作用

姚 藝， 李艷麗, 丁洪成， 陳思思

(湖北省十堰市人民醫(yī)院/湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院內(nèi)分泌科， 湖北 十堰 442000)

糖尿病腎病(Diabeticnephropathy,DN)作為2型糖尿病(T2DM)的主要微血管并發(fā)癥之一，35%～40%的T2DM患者合并DN，是導(dǎo)致終末期腎病(End stage renal disease，ESRD)的關(guān)鍵因素。雖然嚴(yán)格控制血糖和血壓水平可以延緩DN的發(fā)生和進(jìn)展，但這些措施并不能完全防止T2DM患者發(fā)展為腎衰竭[1]。因此，開發(fā)預(yù)防和治療DN的新藥至關(guān)重要。在糖尿病狀態(tài)下，腎小球系膜細(xì)胞增殖，伴隨著腎小球肥大，逐漸導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)沉積在腎小球系膜區(qū)，這導(dǎo)致纖維化成分如纖連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)和細(xì)胞間黏附分子-1 (Intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)的進(jìn)行性積累，并發(fā)展為腎纖維化[2]。在糖尿病的病理狀態(tài)下，高水平的葡萄糖刺激細(xì)胞產(chǎn)生大量活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，活性氧激活下游多種信號通路，從而誘導(dǎo)和加速腎纖維化的發(fā)生[3]。因此，抑制氧化應(yīng)激能有效預(yù)防糖尿病腎纖維化進(jìn)展。芒柄花苷是黃芪、甘草、紅芪等多種中藥的主要活性成分，具有抗氧化活性[4]。研究表明，芒柄花苷通過上調(diào)沉默信息調(diào)節(jié)因子-1(Silent information regulator -1，SIRT1)的表達(dá)來改善肝膽汁淤積[5]。但芒柄花苷改善DN的研究較少。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP activated protein kinase，AMPK)/SIRT1通路是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化通路，AMPK和SIRT1可以協(xié)同作用，通過叉頭盒蛋白O1 (Forkhead box protein O1，F(xiàn)oxO1)介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和自噬調(diào)節(jié)糖尿病引起的腎臟損傷。因此，芒柄花苷可能與AMPK/SIRT1/FoxO1通路介導(dǎo)的DN調(diào)控有潛在的聯(lián)系。因此，本研究探討芒柄花苷對DN大鼠腎損傷的改善作用，并探討其潛在機(jī)制，為芒柄花苷治療DKD提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物:清潔級雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量250±00g，購自上海杰思捷有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2017-0005，在溫度(23±2)℃、濕度(40～70)%、12h晝夜節(jié)律的環(huán)境中自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2主要試劑與儀器:芒柄花苷、二甲雙胍(美國Sigma公司，貨號：4636、2197)；鹽酸片(中美上海施貴寶制藥有限公司，貨號:201702123)；鏈脲佐菌素(美國Sigma公司，貨號:S0103)；蘇木素染色液和Masson染液(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和丙二醛(Malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒(南京建城生物工程有限公司)；蛋白抽提試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；AMPK、SIRT1、FoxO1、FN、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B(Microtubule-associated protein1 light chain3B，LC3B)、β-actin和山羊抗鼠IgG二抗(美國Santa Cruz公司)；AU5800型全自動生化分析儀(美國貝克曼庫爾特)；JT-12K 型脫水機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)； RM2016型病理切片機(jī)(德國Leica公司)；CX-21型普通光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；HBS-1096B型酶標(biāo)儀(南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；電泳儀(北京市六一儀器廠)；MicroPublisher成像系統(tǒng)(美國Q-IMAGING公司)。

1.3分組及造模:選50只成年雄性SD大鼠均分為陰性對照組、模型組、芒柄花苷低劑量組、芒柄花苷高劑量組和陽性對照組。陰性對照組大鼠腹腔注射檸檬酸緩沖液(1mL/100g)，其余各組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(30mg/kg)，72h后測大鼠血糖，血糖>16.7mmoL/L表示造模成功。芒柄花苷低劑量組和芒柄花苷高劑量組大鼠分別灌胃給予芒柄花苷，劑量分別為50mg/kg和200mg/kg[6]，陽性對照組灌胃給予二甲雙胍(250mg/kg)[7]，對照組和模型組灌胃給予等量生理鹽水，持續(xù)16周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時心臟取血，分離血清，自動生化分析儀測定血尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)、血清肌酐(Serum creatinine，Scr)和血糖水平。分離腎臟，右腎置于福爾馬林溶液中國保持，左腎置于液氮中保持。

1.4大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)檢查:右腎組織經(jīng)脫水、包埋、切片(3μm)，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)和Masson染色，用顯微鏡觀察腎組織學(xué)變化。

1.5腎組織中SOD、GSH-PX和MDA水平的檢測:取部分凍存腎組織，用預(yù)冷生理鹽水沖洗3次，制成勻漿，按1mL/100mg的比例加入生理鹽水，離心取上清，然后將相應(yīng)一抗稀釋至10μg/mL，加入到96孔板中(0.1mL/孔)，過夜(4℃)，洗滌3次，加上清液(0.1mL)于上述反應(yīng)孔中，37℃孵育(1h)；加入新配置相對應(yīng)的二抗(0.1mL/孔)，孵育(1h)；加入新配置的3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺底物溶液(0.1mL/孔)進(jìn)行顯色(20min)；加入硫酸(0.05mL)終止反應(yīng)，于450nm處測各孔吸光度(A)值，計(jì)算腎組織中SOD、GSH-PX和MDA水平。

1.6Western Blot法檢測腎組織中AMPK、SIRT1、FoxO1、FN和LC3B水平:取部分凍存腎組織，用預(yù)冷生理鹽水沖洗3次，制成勻漿，按1mL/100mg的比例加入蛋白抽提液，離心后取上清，進(jìn)行電泳(20 μg/孔)，蛋白質(zhì)經(jīng)8%SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，然后用5%脫脂牛奶封閉，將膜與AMPK、SIRT1、FoxO1、FN和LC3B抗體進(jìn)行孵育，孵育過夜(4℃)，洗膜后與相應(yīng)的山羊抗鼠IgG二抗孵育(30min)，顯色后用MicroPublisher成像系統(tǒng)分析蛋白條帶的灰度強(qiáng)度(以β-actin作為內(nèi)對照)。

2 結(jié) 果

2.1芒柄花苷對DN大鼠腎組織形態(tài)學(xué)的影響:HE和Masson染色顯示，陰性對照組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)完好，腎小球系膜內(nèi)未見增生或糖原積累；模型組大鼠腎小球異常肥大，系膜細(xì)胞增殖，系膜基質(zhì)增加，間質(zhì)纖維化；芒柄花苷和二甲雙胍治療后，腎小球形態(tài)逐漸恢復(fù)正常，腎小球內(nèi)的炎癥和纖維化程度也有不同程度的改善。見圖1、2。

圖1 芒柄花苷對DN大鼠腎組織形態(tài)學(xué)的影響(HE染色，×400)

(A：陰性對照組、B：模型組、C：芒柄花苷低劑量組、D:芒柄花苷高劑量組、F:陽性對照組)

2.2芒柄花苷對DN大鼠血清BUN、Scr和血糖水平的影響:與陰性對照組比較，其余各組大鼠血清BUN、Scr和血糖水平升高(P<0.05)；與模型組比較，芒柄花苷低劑量組、芒柄花苷高劑量組和陽性對照組大鼠血清BUN、Scr和血糖降低(P<0.05)；芒柄花苷高劑量組大鼠血清BUN、Scr、血糖與陽性對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 芒柄花苷對DN大鼠血清中BUN Scr和血糖水平的影響

2.3芒柄花苷對DN大鼠腎組織中SOD、GSH-PX和MDA水平的影響:與陰性對照組比較，其余各組大鼠腎組織中SOD和GSH-PX水平降低，MDA水平升高(P<0.05)；與模型組比較，芒柄花苷低劑量組、芒柄花苷高劑量組和陽性對照組大鼠腎組織中SOD和GSH-PX水平升高，MDA水平降低(P<0.05)；芒柄花苷高劑量組大鼠SOD、GSH-PX、MDA與陽性對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 芒柄花苷對DN大鼠腎組織中SOD GSH-PX和MDA水平的影響

2.4芒柄花苷對DN大鼠腎組織中AMPK、SIRT1、FoxO1、FN和LC3B水平的影響:與陰性對照組比較，其余各組大鼠腎組織中AMPK、SIRT1和LC3B水平降低，F(xiàn)oxO1和FN水平升高(P<0.05)；與模型組比較，芒柄花苷低劑量組、芒柄花苷高劑量組和陽性對照組大鼠腎組織中AMPK、SIRT1和LC3B水平升高，F(xiàn)oxO1和FN水平降低(P<0.05)；芒柄花苷高劑量組大鼠AMPK、SIRT1、FoxO1、FN、LC3B與陽性對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3和圖3。

表3 芒柄花苷對DN大鼠腎組織中AMPK SIRT1 FoxO1 FN和LC3B水平的影響

圖2 芒柄花苷對DN大鼠腎組織形態(tài)學(xué)的影響(Masson染色，×400)

(A：陰性對照組、B：模型組、C：芒柄花苷低劑量組、D:芒柄花苷高劑量組、F:陽性對照組)

圖3 芒柄花苷對DN大鼠腎組織中AMPK、SIRT1、FoxO1、FN和LC3B水平的影響

(A：陰性對照組、B：模型組、C：芒柄花苷低劑量組、D:芒柄花苷高劑量組、F:陽性對照組)

3 討 論

遺傳易感性和高血糖被認(rèn)為是DN的觸發(fā)因素。代謝紊亂導(dǎo)致腎臟氧化應(yīng)激增加，促進(jìn)足細(xì)胞損傷和腎小管間質(zhì)纖維化，隨著病情進(jìn)展，最終導(dǎo)致ESRD。二甲雙胍是治療T2DM的一線藥物，可維持T2DM患者糖脂代謝平衡，抑制腎纖維化，具有一定的腎保護(hù)作用，但二甲雙胍只能延緩DN的進(jìn)展，并不能根治DN。因此，尋找新的DN治療藥物尤為重要。芒柄花苷作為一種異黃酮化合物，能增強(qiáng)機(jī)體對氧化應(yīng)激的抵抗力，對動脈粥樣硬化和神經(jīng)損傷發(fā)揮保護(hù)作用。氧化應(yīng)激是腎纖維化加重的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也可加速DN的進(jìn)展[8]。因此，本研究推測芒柄花苷可能也可以通過其抗氧化能力改善DN。本研究結(jié)果顯示，芒柄花苷可顯著降低DN大鼠血清BUN、Scr和血糖水平，且呈劑量依賴性。同時，HE和Masson’s染色顯示，芒柄花苷治療后腎小球形態(tài)逐漸恢復(fù)正常，腎小球內(nèi)炎癥和纖維化程度也有不同程度的改善，說明芒柄花苷能明顯改善DN大鼠腎功能。此外，芒柄花苷能顯著促進(jìn)DN大鼠腎組織中SOD和GSH-PX表達(dá)，抑制MDA表達(dá)，說明內(nèi)源性細(xì)胞防御機(jī)制在抵抗氧化應(yīng)激和維持細(xì)胞狀態(tài)中起著重要作用。

氧化應(yīng)激和自噬受損是DN腎損傷的重要機(jī)制。自噬在多種腎臟疾病模型中起保護(hù)作用，隨著年齡的增長，缺氧減弱了自噬，導(dǎo)致ROS在腎臟受損的線粒體和線粒體中積累。LC3B在自噬的整個過程中起作用，可反映自噬水平。在糖尿病晚期，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境紊亂極大地抑制了腎臟自噬，抑制AMPK/SIRT1通路，最終導(dǎo)致自噬失代償，加速了DN進(jìn)展[9]。二甲雙胍可以通過激活A(yù)MPK磷酸化正向調(diào)節(jié)自噬。研究表明，SIRT1抑制劑EX527可抑制二甲雙胍上調(diào)AMPK/SIRT1信號通路，抑制自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)FN的表達(dá)[10]。因此，本研究推測芒柄花苷可能通過AMPK/SIRT1/FOXO1促進(jìn)DN自噬，減輕腎臟損傷。

轉(zhuǎn)錄因子家族FoxO通過調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞周期阻滯、DNA修復(fù)和凋亡，在細(xì)胞增殖和存活中發(fā)揮核心作用。其中FoxO1被認(rèn)為是糖尿病動物模型中參與氧化應(yīng)激、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制自噬的重要調(diào)節(jié)因子[11]。在氧化應(yīng)激下，提高FoxO1轉(zhuǎn)錄活性可以抑制自噬，降低抗氧化酶的表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞存活。FoxO1的去乙酰化也促進(jìn)了FoxO1與自噬相關(guān)基因7的相互作用，同時抑制了自噬因子LC3B的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，芒柄花苷能促進(jìn)腎組織中AMPK、SIRT1和LC3B水平，降低FoxO1和FN，促進(jìn)腎組織細(xì)胞自噬，抑制腎纖維化，發(fā)揮DN保護(hù)作用，且芒柄花苷高劑量組作用與二甲雙胍類似。

綜上所述，芒柄花苷可明顯減輕DN大鼠糖代謝異常和腎臟損害，抑制腎纖維化，其機(jī)制可能與芒柄花苷激活A(yù)MPK和SIRT1表達(dá)，抑制FoxO1表達(dá)，改善腎臟氧化應(yīng)激狀況，抑制自噬，從而緩解DN的發(fā)生發(fā)展過程。