circ_0000615靶向調控miR-142-3p對骨肉瘤細胞增殖遷移侵襲的影響

李賀偉， 阮 鋒

(華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院， 湖北 武漢 430077)

骨肉瘤具有病情進展快、轉移早、預后差、易復發等特點，靶向治療是在特定導向機制作用下將藥物選擇性濃集定位于特定結構，可提高腫瘤局部治療效果；靶向治療骨肉瘤藥物的研發及臨床應用已經取得一定療效，從基因角度入手找到精準的靶向治療藥物是目前分子靶向治療研究的重點[1,2]。miRNA不僅影響骨肉瘤細胞的代謝，還參與骨肉瘤的發生、轉移和復發，研究miRNA在骨肉瘤中的作用可為骨肉瘤的早期診斷和治療提供新的研究方向[3]。研究發現miR-142-3p在骨肉瘤組織和細胞中表達均明顯下調，過表達miR-142-3p通過調控靶基因HMGA1的表達抑制骨肉瘤細胞的生長、侵襲和遷移[4]。攜帶miR-142-3p的外泌體可通過抑制COX-2的表達來抑制骨肉瘤細胞的生長。Circular RNA Interactome在線軟件預測顯示circ_0000615和miR-142-3p有互補序列。circ_0000615是來源轉錄因子ZNF609的一種circRNA，位于chr15:64791491-64792365；研究報道circ-ZNF609高表達促進腎癌細胞增殖和侵襲能力[5]。乳腺癌患者血漿中has_circ_0000615高表達，與腫瘤分期、淋巴結轉移密切相關。circ_0000615在鼻咽癌組織和細胞中高表達，敲低circ_0000615抑制鼻咽癌細胞的增殖、遷移、侵襲和上皮間質轉化(EMT)[6]。然而circ_0000615對骨肉瘤細胞惡性生物學行為的影響尚不清楚。本實驗旨在研究circ_0000615可否通過調控miR-142-3p影響骨肉瘤細胞的惡性生物學行為。

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1臨床材料：選取2017年1月至2021年1月本院收治的60例骨肉瘤患者的骨肉瘤組織及瘤旁組織患者手術前未進行過放化療，所有患者均經病理學診斷確診為骨肉瘤，排除標準：合并其他惡性腫瘤；全身系統性疾病者。本研究經本院倫理委員會批準，所有患者及其家屬知情且簽署知情同意書。

1.1.2細胞與主要試劑：骨肉瘤細胞U2OS(美國ATCC)；Trizol試劑、實時熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒(日本Takara公司)；蛋白提取試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium assay，MTT)比色法試劑盒(北京Solarbio公司)；Transwell小室、基質膠(美國BD公司)；熒光素酶報告基因載體(美國Promega公司)。

1.1.3主要儀器：3550型酶標儀(美國Thermo Fisher)，AB7500 Real-Time PCR儀(美國Applied Biosystems)。

1.2方 法

1.2.1細胞處理與分組：于RPMI-1640培養基中常規培養骨肉瘤細胞U2OS，將circ_0000615干擾表達載體及陰性對照、miR-142-3p模擬物及陰性對照miR-NC轉染至U2OS細胞，記為si-circ_0000615組、si-NC組、miR-142-3p組、miR-NC組；將circ_0000615干擾表達載體分別與miR-142-3p抑制劑及陰性對照轉染至U2OS細胞，記為si-circ_0000615+anti-miR-142-3p組、si-circ_0000615+anti-miR-NC組。

1.2.2RT-qPCR檢測circ_0000615和miR-142-3p表達：骨肉瘤組織、瘤旁組織、轉染的骨肉瘤細胞U2OS的總RNA采用Trizol試劑提取，根據試劑盒進行反轉錄、隨后配置PCR反應體系，檢測circ_0000615和miR-142-3p表達。PCR反應條件如下：95℃預變性5min，95℃變性15s，59℃退火15s，共40個循環。根據2-△△Ct法計算相對表達量。circ_0000615引物序列：F 5’-TTGGGAACTAAACCGGAGCC-3’，R 5’-GGACAACATCATTGCTTTTCAGAC-3’；GAPDH引物序列：F 5’-TATCGTGATGCTAGTCCGATG-3’，R 5’-TGCAGCTAGCTGCATCGATCGG-3’；miR-142-3p引物序列：F 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGG-3’，R 5’-CGACGTGTAGTGTTTCCTA-3’；U6引物序列：F 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，R 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.2.3MTT測定細胞增殖抑制率：各組細胞培養48h，按試劑盒說明操作，測定490nm處吸光度(OD)值。計算細胞增殖抑制率(%)。

1.2.4克隆形成實驗檢測細胞克隆數：將各組U2OS細胞接種于6孔板，調整細胞密度后取出相應體積，統計每孔細胞數，每孔100個，培養2周，將甲醇、吉姆薩分別進行固定與染色，細胞克隆數(>50個細胞)在光學顯微鏡下統計。

1.2.5Transwell法檢測細胞遷移和侵襲數：遷移：U2OS用無血清培養液饑餓24h，調整細胞濃度為5×105/mL，Transwell上室加入100μL上述細胞懸液，培養24h，分別以甲醇、0.1%結晶紫進行固定、染色，于顯微鏡下記數。侵襲：基質膠包被Transwell上室，其余同遷移實驗操作。

1.2.6蛋白質印跡(Western blot)法：借助蛋白提取試劑盒獲得U2OS細胞總蛋白，進行SDS-PAGE、轉聚偏二氟乙烯膜，聚偏二氟乙烯膜封閉1h后，加入E-cadherin(美國Abcam)、N-cadherin(美國Abcam)和GAPDH抗體(美國Abcam)后4℃孵育12h，室溫加入二抗，孵育2h后化學發光液顯影，分析E-cadherin、N-cadherin蛋白條帶相對于GAPDH的灰度值。

1.2.7雙熒光素酶報告實驗：分別將circ_0000615野生型/突變型(WT/MUT)熒光素酶載體與miR-142-3p模擬物或陰性對照miR-NC共轉染U2OS細胞，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒操作指南，測量熒光素酶活性。

2 結 果

2.1circ_0000615和miR-142-3p在骨肉瘤中的表達：骨肉瘤組織中circ_0000615表達水平高于瘤旁組織(2.06±0.33比1.00±0.18，t=21.843)，miR-142-3p表達水平低于瘤旁組織(0.44±0.10比1.06±0.13，t=27.865)，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 骨肉瘤中circ_0000615和miR-142-3p表達

2.2沉默circ_0000615對U2OS增殖遷移侵襲的影響：與si-NC組相比，si-circ_0000615組circ_0000615表達水平降低，U2OS細胞抑制率升高，U2OS細胞克隆數、遷移侵襲數降低，E-cadherin表達升高，N-cadherin表達下降(P<0.05)，見圖2。

圖2 沉默circ_0000615對U2OS增殖遷移侵襲的檢測

2.3circ_0000615靶向調控miR-142-3p：Circular RNA Interactome在線軟件預測顯示circ_0000615和miR-142-3p有互補序列，見圖3A。miR-142-3p與circ_0000615野生型報告質粒共轉染后細胞熒光素酶活性降低(P<0.05)，見圖3B；與si-NC組相比，si-circ_0000615組miR-142-3p表達水平升高(P<0.05)，見圖3C。

圖3 circ_0000615靶向調控miR-142-3p

2.4miR-142-3p抑制U2OS增殖遷移侵襲：與miR-NC組相比，miR-142-3p組U2OS細胞中miR-142-3p表達水平升高，細胞抑制率上升，U2OS細胞克隆數、遷移和侵襲數減少，E-cadherin表達水平升高，N-cadherin表達水平降低(P<0.05)，見圖4。

2.5抑制miR-142-3p和circ_0000615誘導U2OS增殖遷移侵襲：與si-circ_0000615+anti-miR-NC組相比，si-circ_0000615+anti-miR-142-3p組U2OS細胞中miR-142-3p表達、U2OS細胞抑制率、E-cadherin表達降低，U2OS細胞克隆數、遷移侵襲數增加，N-cadherin表達升高(P<0.05)，見圖5。

圖4 miR-142-3p對U2OS增殖遷移侵襲的檢測

圖5 抑制miR-142-3p和circ_0000615對U2OS增殖遷移侵襲的檢測

3 討 論

骨肉瘤是一種高度侵襲性的癌癥。最近，非編碼RNA在骨肉瘤中的失調引起了科學界的極大興趣。既往研究表明，circRNAs在多種癌癥中的作用，包括胃癌、結直腸癌等[7,8]。circ_0000615(circ-ZNF609)是近幾年新發現的一種circRNA，研究報道circ-ZNF609能促進不同腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，例如宮頸癌[9]、胃癌[10]、膠質瘤[11]。然而，circ_0000615在骨肉瘤中的表達和作用尚不清楚。本實驗結果顯示，骨肉瘤組織中circ_0000615高表達，提示circ_0000615可能與骨肉瘤發生發展有關。本研究還發現，沉默circ_0000615后，U2OS細胞增殖和遷移侵襲能力下降，E-cadherin表達升高，N-cadherin表達降低，提示沉默circ_0000615可抑制U2OS細胞增殖、遷移和侵襲，與circ_0000615在鼻咽癌、宮頸癌、胃癌、膠質瘤中的功能相吻合。

為深入研究circ_0000615在骨肉瘤中的作用機制，本研究通過在線軟件預測到miR-142-3p可能是circ_0000615的靶基因。研究報道miR-142-3p在骨肉瘤細胞中表達下調，對骨肉瘤細胞生長和進展有抑制作用[12]。本實驗結果顯示，miR-142-3p在骨肉瘤組織中低表達，且過表達miR-142-3p后，U2OS細胞增殖、遷移侵襲能力下降，N-cadherin表達降低，與前人報告吻合。本實驗還發現circ_0000615靶向調控miR-142-3p；抑制miR-142-3p可減輕circ_0000615對U2OS細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，提示沉默circ_0000615對骨肉瘤細胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用的分子機制與靶向下調miR-142-3p表達相關。

綜上所述，沉默circ_0000615可通過靶向調控miR-142-3p抑制骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。但關于其下游靶基因尚需下一步探究。