喬松素通過調節HIF-1α/BNIP3信號通路介導細胞自噬減輕缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷

劉 冰, 方存明, 馬小林

(安徽省宣城市人民醫院心血管內科， 安徽 宣城 242000)

缺血性心臟疾病是心內科常見的疾病，在世界范圍內發病率和死亡率均很高，及時、有效的血液再灌注是主要治療手段，但常常引發心肌缺血/再灌注損傷，給缺血心肌組織造成更嚴重的損傷，因此采取針對性措施控制缺血/再灌注過程中的心肌受損，是缺血性心臟疾病臨床治療中亟需解決的難點[1]。自噬是真核細胞內特有的依賴于溶酶體的胞內物質分解代謝過程，對于維持缺血/再灌注過程中細胞內環境穩態至關重要，促進自噬可減輕氧糖剝奪/再灌注引發的神經細胞損傷[2]，自噬貫穿心肌缺血/再灌注損傷全過程，通過促進自噬流量可抑制心肌缺血/再灌注引發的心肌細胞凋亡和壞死性下垂，研究發現增強自噬，并降低炎癥和氧化應激水平可明顯減輕缺氧/復氧誘發的心肌細胞H9c2損傷，有效防治心肌梗死[3]。缺氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)/bcl2/腺病毒E1B相互作用蛋白3(bcl2/Adenovirus E1B 19kDa Interacting Protein 3，BNIP3)可通過調控細胞和線粒體自噬介導各組織器官缺血/再灌注損傷過程，敲除HIF-1α基因可其下游因子降低bcl2/腺病毒E1B相互作用蛋白3(bcl2/Adenovirus E1B 19kDa Interacting Protein 3，BNIP3)表達，顯著減弱線粒體自噬，促進活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)產生，加重缺氧/復氧誘導的腎小管細胞損傷凋亡[4]，上調HIF-1α、BNIP3表達可增強自噬作用，減輕缺氧誘導的視網膜色素上皮細胞炎癥損傷，增強其生存能力[5]，還可通過促進自噬和抑制凋亡而減輕缺氧復氧導致的H9c2細胞損傷[6]。喬松素是提取自蜂膠的一種天然黃酮類化合物，具有廣泛的抗炎、抗氧化活性，可通過抑制氧化應激改善高脂飼養誘導的非酒精性脂肪性肝病大鼠癥狀[7]，并減輕缺血/再灌注引發的腸黏膜損傷[8]，還可激活自噬，減輕缺血再灌注造成的心肌細胞凋亡損傷，對心肌組織發揮保護作用，但其是否是通過調節HIF-1α/BNIP3信號實現的，目前還不清楚，本文對大鼠心肌細胞H9c2進行缺氧/復氧處理，構建心肌缺血/再灌注體外損傷模型，探究喬松素通過調控HIF-1α/BNIP3介導的細胞自噬減輕缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷的機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器：大鼠心肌細胞H9c2(武漢普諾賽生命科技有限公司)-貨號：CL-0089；喬松素(純度:HPLC≥98%)、MTT試劑盒/細胞增殖檢測試劑盒、大鼠白細胞介素(interleukin，IL)-18(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒、大鼠IL-17 ELISA試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)、-貨號：IP0920、M1020、SEKR-0054、SEKR-0007；ROS檢測試劑盒(北京盒子生工科技有限公司)-貨號：AKCE002-1；Annexin V 凋亡檢測試劑盒(FITC/PI雙染法)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性檢測試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量檢測試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)-貨號：E606336、D799598、D799762；單丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverine,MDC)(上海懋康生物科技有限公司)-貨號：MX4453；BCA蛋白檢測試劑盒、兔源抗大鼠P62一抗、兔源抗大鼠HIF-1α一抗、兔源抗大鼠LC3一抗、兔源抗大鼠BNIP3一抗(美國Abcam公司)-貨號：ab102536、ab109012、ab179483、ab48394、ab109362；大鼠IL-1β ELISA試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)檢測試劑盒、辣根過氧化物酶偶聯山羊抗兔IgG二抗、兔源抗大鼠Anti-β-actin一抗(上海碧云天生物技術有限公司)-貨號：PI303、S0057S、A0208、AF5003等。流式細胞儀(美國BD公司)-型號：Accuri C6；高級倒置熒光顯微鏡(上海普丹光學儀器有限公司)-型號：ICX41LED；迷你垂直電泳轉印系統、電泳儀電源、酶標儀(美國Bio-Rad公司)-型號：1658033、PowerPac Basic 1645050、JC-1089A；全自動凝膠成像分析系統(北京賽智創業科技有限公司)-型號：ChampGel 6000等。

1.2方 法

1.2.1喬松素作用濃度篩選：大鼠心肌細胞H9c2快速解凍后復蘇，以含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養基培養，傳代后接種在無菌的96孔板中，以1×104個/孔的密度培養24h，然后在94%N2、5%CO2、1%O2的低氧環境中培養4h后移至21%O2、5%CO2的正常氧環境中繼續培養6h，制備缺氧/復氧模型[9]，接著馬上分別以0、25、50、100、200、300μg/mL喬松素處理[10]，以0μg/mL的喬松素做對照，未接種細胞的孔做空白對照，24h后采用MTT試劑盒測定各組細胞活力，具體參照制造商說明書中方法操作，計算公式為=(藥物處理組吸光值-空白對照組吸光值)/(對照組吸光值-空白對照組吸光值)×100%。

1.2.2心肌細胞缺氧/復氧模型制備及分組處理：H9c2細胞傳代后接種在無菌的24孔板中，以1×105個/孔的密度培養24h，隨機分為對照組、模型組、喬松素低劑量組、喬松素高劑量組、HIF-1α siRNA陰性對照組、喬松素高劑量+HIF-1α siRNA組，除對照組外其余各組H9c2細胞建立缺氧/復氧模型后，馬上進行分組處理：對照組和模型組不進行處理，喬松素低劑量組和喬松素高劑量組分別以100、200μg/mL喬松素進行處理，HIF-1α siRNA陰性對照組以脂質體2000轉染HIF-1α siRNA，喬松素高劑量+HIF-1α siRNA組以200μg/mL喬松素進行處理的同時轉染HIF-1α siRNA陰性對照，各組細胞均處理24h后收集其培養液和細胞沉淀備用。

1.2.3MTT法、流式細胞實驗分別檢測各組細胞增殖及凋亡：H9c2細胞傳代后接種在無菌的96孔板中，以1×104個/孔的密度培養24h，以1.2.2中方法分組處理24h后，采用MTT法測定各組細胞活力，方法見1.2.1。以DMEM培養基重懸1.2.2中收集的各組細胞，混勻后測定細胞密度，每組取1×105個細胞經PBS洗滌后，采用Annexin V凋亡檢測試劑盒進行FITC/PI雙染，具體參照制造商說明書中方法操作，以PBS洗滌后置于流式細胞儀中測定各組細胞凋亡率。

1.2.4ELISA測量各組H9c2細胞炎性因子IL-17、IL-1β、IL-18及氧化應激因子CAT、GSH-Px、ROS、MDA水平：1.2.2中收集的各組細胞培養液，以2000r/min離心10min后取上清，采用ELISA試劑盒測量其中炎性因子IL-17、IL-1β、IL-18水平，具體參照各自制造商說明書中方法操作。1.2.2中收集的各組細胞，以RIPA裂解液分別裂解提取其中總蛋白，以BCA法測出其濃度，然后采用試劑盒測量細胞蛋白樣品液中氧化應激因子CAT、GSH-Px、ROS、MDA水平，具體參照各自制造商說明書中方法操作。

1.2.5MDC熒光染色法檢測各組H9c2細胞自噬體形成：H9c2細胞傳代后接種在無菌的96孔板中，以1×105個/孔的密度培養24h，以1.2.2中方法分組處理24h后，加入含有50μmoL/L MDC的DMEM培養基，避光培養30min，棄去培養基，洗滌后以50%磷酸甘油固定細胞，在高級倒置熒光顯微鏡中觀察各組細胞自噬體形成并拍照，計算各組自噬體相對含量=藥物處理組自噬體數目/對照組自噬體數目×100%。

1.2.6免疫印跡法檢測各組H9c2細胞自噬及HIF-1α/BNIP3通路相關蛋白表達：1.2.2中收集的各組細胞，以RIPA裂解液分別裂解提取其中總蛋白，以BCA法測出其濃度后，每組取20g進行變性、上樣跑電泳使蛋白按分子量大小分散在凝膠中，通過濕轉將膠中蛋白轉至硝酸纖維素膜，按照LC3、P62、HIF-1α、BNIP3、β-actin這5種蛋白分子量將其自膜上剪下，分別孵育5%脫脂奶粉、相應一抗、山羊抗兔二抗后對二抗偶聯的辣根過氧化物酶顯色，拍照后以軟件ImageJ分析，對各組蛋白灰度值定量后統計得出其相對表達。

2 結 果

2.1喬松素對缺氧復氧誘導的H9c2細胞活力的影響：不同濃度喬松素可增強缺氧復氧誘導的H9c2細胞活力，并隨劑量升高而作用增強，在濃度為200mg/L時進入平臺期，因而選擇100、200μg/mL喬松素進行后續實驗。見圖1。

2.2喬松素對缺氧復氧誘導的H9c2細胞增殖與凋亡的影響：與對照組相比，模型組細胞活力降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)。與模型組相比，喬松素低、高劑量組細胞活力均升高(P<0.05)，凋亡率均降低(P<0.05)；喬松素高劑量組細胞活力相比喬松素低劑量組進一步升高(P<0.05)，凋亡率進一步降低(P<0.05)；HIF-1α siRNA陰性對照組細胞活力、凋亡率無顯著差異(P>0.05)。與喬松素高劑量組相比，喬松素高劑量+HIF-1α siRNA組細胞活力降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)。見圖2、表1。

圖1 不同濃度喬松素對缺氧復氧誘導的H9c2細胞活力的影響

圖2 流式細胞實驗檢測各組H9c2細胞凋亡

2.3喬松素對缺氧復氧誘導的H9c2細胞炎性因子產生的影響：與對照組相比，模型組細胞培養基上清中IL-17、IL-1β、IL-18水平升高(P<0.05)。與模型組相比，喬松素低、高劑量組細胞培養基上清中IL-17、IL-1β、IL-18水平均降低(P<0.05)；喬松素高劑量組細胞培養基上清中IL-17、IL-1β、IL-18水平相比喬松素低劑量組進一步降低(P<0.05)；HIF-1α siRNA陰性對照組細胞培養基上清中IL-17、IL-1β、IL-18水平無顯著差異(P>0.05)。與喬松素高劑量組相比，喬松素高劑量+HIF-1α siRNA組細胞培養基上清中IL-17、IL-1β、IL-18水平升高(P<0.05)。見表2。

表1 各組H9c2細胞活力與凋亡率

表2 各組H9c2細胞培養基上清中IL-17 IL-1β IL-18水平

2.4喬松素對缺氧復氧誘導的H9c2細胞氧化應激因子產生的影響：與對照組相比，模型組細胞CAT、GSH-Px水平降低(P<0.05)，ROS、MDA水平升高(P<0.05)。與模型組相比，喬松素低、高劑量組細胞CAT、GSH-Px水平均升高(P<0.05)，ROS、MDA水平均降低(P<0.05)；喬松素高劑量組細胞CAT、GSH-Px水平相比喬松素低劑量組進一步升高(P<0.05)，ROS、MDA水平進一步降低(P<0.05)；HIF-1α siRNA陰性對照組細胞CAT、GSH-Px、ROS、MDA水平無顯著差異(P>0.05)。與喬松素高劑量組相比，喬松素高劑量+HIF-1α siRNA組細胞CAT、GSH-Px水平降低(P<0.05)，ROS、MDA水平升高(P<0.05)。見表3。

表3 各組H9c2細胞CAT GSH-Px ROS MDA水平

表4 各組H9c2細胞自噬體相對含量

2.5喬松素對缺氧復氧誘導的H9c2細胞自噬體形成的影響：與對照組相比，模型組細胞自噬體相對含量降低(P<0.05)。與模型組相比，喬松素低、高劑量組細胞自噬體相對含量均升高(P<0.05)；喬松素高劑量組細胞自噬體相對含量相比喬松素低劑量組進一步升高(P<0.05)；HIF-1α siRNA陰性對照組細胞自噬體相對含量無顯著差異(P>0.05)。與喬松素高劑量組相比，喬松素高劑量+HIF-1α siRNA組細胞自噬體相對含量降低(P<0.05)。見圖3、表4。

2.6喬松素對缺氧復氧誘導的H9c2細胞自噬及HIF-1α/BNIP3通路相關蛋白表達的影響：與對照組相比，模型組細胞LC3-II/LC3-I及P62、HIF-1α、BNIP3蛋白表達降低(P<0.05)。與模型組相比，喬松素低、高劑量組細胞LC3-II/LC3-I及P62、HIF-1α、BNIP3蛋白表達均升高(P<0.05)；喬松素高劑量組細胞LC3-II/LC3-I及P62、HIF-1α、BNIP3蛋白表達相比喬松素低劑量組進一步升高(P<0.05)；HIF-1α siRNA陰性對照組細胞LC3-II/LC3-I及P62、HIF-1α、BNIP3蛋白表達無顯著差異(P>0.05)。與喬松素高劑量組相比，喬松素高劑量+HIF-1α siRNA組細胞LC3-II/LC3-I及P62、HIF-1α、BNIP3蛋白表達降低(P<0.05)。見圖4、表5。

表5 各組H9c2細胞自噬及HIF-1α/BNIP3通路相關蛋白相對表達

圖3 MDC熒光染色法檢測各組H9c2細胞自噬體的形成(×400)

圖4 免疫印跡法檢測各組H9c2細胞自噬及HIF-1α/BNIP3通路相關蛋白表達(×400)

3 討 論

缺血性心臟病作為臨床常見心血管疾病，經皮冠狀動脈介入治療及冠狀動脈旁路移植等是現代醫學采用的主要治療策略，但由于缺血/再灌注損傷的存在，患者治療后心衰發生率仍然較高，因此減輕心肌缺血/再灌注損傷是改善心肌缺血患者預后的關鍵[11,12]。心肌細胞缺氧/復氧模型是研究體外心肌缺血/再灌注損傷的常用模型，本文對H9C2細胞進行缺氧4h/復氧6h處理造模，結果顯示，H9C2細胞經缺氧/復氧處理后，其細胞活力、細胞CAT及GSH-Px水平降低，凋亡率、細胞培養基上清中IL-17、IL-1β及IL-18水平、細胞ROS及MDA水平升高，表明缺氧/復氧可誘發ROS和炎性因子大量產生，導致高水平的炎癥與氧化應激，導致心肌細胞活力降低，誘導其凋亡，揭示心肌細胞缺氧/復氧模型構建成功。

心肌缺血/再灌注損傷發生的重要病理基礎是炎癥、氧化應激、心肌細胞凋亡和自噬受限等，研究證實，促進自噬及抑制炎癥因子表達可顯著改善缺氧/復氧損傷的H9C2細胞活力，保護心肌組織免于缺血再灌注損傷[13,14]。喬松素作為一種具有明顯抗氧化與抗炎作用的天然化合物，對缺血/再灌注引發的組織細胞損傷發揮有效的保護作用，其機制與激活自噬、減輕氧化應激與炎癥、抑制凋亡有關，不僅可改善肝缺血再灌注損傷導致的肝臟損傷，還可抑制缺血再灌注造成的心肌細胞凋亡，減弱心肌缺血再灌注后的血管收縮功能，本文以不同劑量喬松素處理缺氧/復氧H9c2細胞，均可升高細胞活力、自噬體相對含量、細胞CAT及GSH-Px水平、細胞LC3-II/LC3-I及P62蛋白表達，并降低細胞凋亡率、細胞培養基上清中IL-17、IL-1β及IL-18水平、細胞ROS及MDA水平，且高劑量喬松素作用更強，表明喬松素可降低ROS和炎性因子產生水平，抑制炎癥與氧化應激，促進自噬，減輕缺氧/復氧導致的心肌細胞凋亡，促使其存活，揭示喬松素可保護心肌細胞免于缺氧/復氧誘發的損傷，劑量越高，作用越強。

HIF-1α/BNIP3是重要的自噬調控信號，與缺血/再灌注造成的一系列組織細胞損傷過程關系密切，上調HIF-1α/BNIP3通路表達可通過抑制腎缺血再灌注引發的腎小管上皮細胞凋亡減輕大鼠腎損傷[15]，還可增強細胞及其線粒體自噬，減輕缺氧復氧所致的H9c2細胞凋亡損傷，提高細胞活力，起到顯著的心肌保護作用，本文結果顯示，缺氧/復氧處理可下調H9c2細胞HIF-1α、BNIP3蛋白表達，而缺氧/復氧H9c2細胞以不同劑量喬松素處理后HIF-1α、BNIP3蛋白表達均升高，表明HIF-1α/BNIP3信號參與介導缺氧/復氧引發的H9c2細胞損傷及喬松素對此損傷的減輕過程，另外以喬松素和HIF-1α siRNA聯合處理缺氧/復氧H9c2細胞，相比喬松素單獨處理，可降低細胞活力、自噬體相對含量、細胞CAT及GSH-Px水平、細胞LC3-II/LC3-I及P62、HIF-1α、BNIP3蛋白表達，升高細胞凋亡率、細胞培養基上清中IL-17、IL-1β及IL-18水平、細胞ROS及MDA水平，表明以HIF-1α siRNA下調HIF-1α/BNIP3通路蛋白表達，可減弱喬松素的抗炎與抗氧化應激作用，拮抗其對自噬的增強作用，最終逆轉喬松素對缺氧/復氧引發的H9c2細胞損傷凋亡的抑制作用，揭示喬松素激活自噬，減輕缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷是通過上調HIF-1α表達實現的。

綜上所述，喬松素可增強HIF-1α/BNIP3通路蛋白表達，促進自噬，降低炎癥因子產生水平，抑制炎癥與氧化應激發生發展，抑制缺氧/復氧誘導的心肌細胞凋亡，提高其細胞存活能力，最終明顯減輕細胞損傷，上調HIF-1α/BNIP3通路可能是其藥理機制，本文有助于深入全面的闡釋心肌缺血/再灌注損傷發生機制，并為臨床防治心肌缺血/再灌注損傷的發生發展提供了新的候選藥物，對缺血性心臟病的治療做出了一定貢獻。