山梨醇對黑曲霉源α-L-鼠李糖苷酶(r-Rha1)熱穩定性的影響

葉家影， 孫 江， 李文靜， 倪 輝*，2，3， 李利君，2，3， 李清彪，2，3

（1.集美大學 海洋食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.集美大學 福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建 廈門 361021；3.集美大學 廈門市食品生物工程技術研究中心，福建 廈門 361021）

酶在提高生物催化效率的應用中發揮著重要作用，天然酶通常只能根據自身的需要進化相應的催化性能[1]。在工業上使用酶時，需要探索提高其對工業相關底物活性的方法，也應針對這些酶進行工業反應條件的優化。高熱穩定性一直是生物催化劑在工業應用中的重要性能，也是限制酶工業化應用的重要因素[2]。酶熱穩定性的強弱決定著酶的利用率、生產效率和生產成本[3]等。因此，提高熱穩定性是改善工業用酶屬性的重要目標。

催化過程中的熱環境會加速酶蛋白的變性，為提高酶蛋白的熱穩定性，可根據其序列、結構、功能及催化機理進行理性設計，以獲得具有良好特性的突變體酶或重組酶[4-7]。在以往的研究中，作者所在團隊通過PoPMuSiC算法和α-L-鼠李糖苷酶表面賴氨酸-精氨酸突變提高了α-L-鼠李糖苷酶熱穩定性[8-9]。多羥基化合物山梨醇價格低廉、儲量豐富，是美國能源部提出的可持續平臺化學品之一[10]，在食品、化妝品和醫藥工業中有廣泛用途[11]。隨著研究的深入，山梨醇也被廣泛用作酶穩定劑[12]。山梨醇作為外源添加劑在提高酶的穩定性方面具有操作簡單、成本低及生物降解性良好等優勢[13]，Narayanan等研究發現添加山梨醇可緩解釀酒酵母伴侶蛋白突變體的溫度敏感性[14]，Mohammadi等發現添加山梨醇可提高羧肽酶A的轉變溫度（Tm）、活性和穩定性[15]。但目前對山梨醇影響黑曲霉源α-L-鼠李糖苷酶熱穩定性機制仍不明確。

α-L-鼠李糖苷酶是一種糖苷水解酶，主要作用于α-1，2、α-1，4、α-1，6糖苷鍵，能有效水解大多數糖苷末端的帶有鼠李糖基團的黃酮類化合物，如橙皮苷、斛皮苷、柚皮苷及人工底物對硝基苯基-α-L-鼠李糖苷（p-nitrophenyl-α-L-rhamnoside，pNPR）等。α-L-鼠李糖苷酶在食品行業有廣泛應用，如柑橘果汁的脫苦與澄清[16-17]、飲料香氣成分的改善[18]、紅酒風味的改善[19]等；此外，在醫藥行業和化合物的前體合成也有重要應用[20]。但已報道的大多數α-L-鼠李糖苷酶在較高溫度下熱穩定性差[21-23]，因而限制了其工業應用。已有研究表明，添加山梨醇可增強土曲霉源α-L-鼠李糖苷酶的熱穩定性[24]。作者以黑曲霉源α-L-鼠李糖苷酶r-Rha1為對象，通過熱失活動力學、圓二色譜和熒光光譜的譜學分析，探討山梨醇對α-L-鼠李糖苷酶熱穩定性影響，并從分子構象及二級結構變化方面研究山梨醇對α-L-鼠李糖苷酶的保護機理，促進人們對山梨醇與α-L-鼠李糖苷酶相互作用的理解，同時為提高其他酶制劑產品穩定性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種含pPIC9K-rha重組質粒的畢赤酵母SMD1168由集美大學海洋食品與生物工程學院酶工程實驗室保藏[25]。

1.1.2 試劑pNPR與甲醇（GR）：Sigma-Aldrich公司產品；山梨醇（AR）：阿拉丁上海有限公司產品；甘油、葡萄糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉：國藥集團化學試劑有限公司產品；胰蛋白胨、酵母粉：廣東環凱微生物科技有限公司產品；生物素、無氨基酸酵母氮源（yeast nitrogen base without amino acids，YNB）：北京索萊寶生物公司產品。

酵母浸出粉胨葡萄糖培養基 （yeast extract peptone dextrose medium，YPD）：20 g胰蛋白胨、20 g葡萄糖、10 g酵母粉溶解于1 L去離子水中，調節pH至6.0，高壓滅菌。

緩沖甘油-復合培養基 （buffered glycerolcomplex medium，BMGY）：20 g胰蛋白胨、10 g酵母粉溶解于700 mL去離子水中，高壓滅菌，冷卻后加入100 mL磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）、100 mL 10×YNB、100 mL甘油、2 mL 0.02 g/dL生物素B。

緩沖甲醇-復合培養基 （buffered methanolcomplex medium，BMMY）：20 g胰蛋白胨、10 g酵母粉溶解于700 mL去離子水中，高壓滅菌，冷卻后加入100 mL磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）、100 mL 10×YNB、100 mL甲醇、2 mL 0.02 g/dL生物素B。

1.2 儀器與設備

DK-8D數顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司產品；FE20 pH計：瑞士Mettler Toledo公司產品；Avanti J-26S XP立式高速冷凍離心機：美國Beckman公司產品；Infiniti M200 PRO酶標儀：奧地利Tecan公 司 產 品；Sephacryl S-200柱：美 國Amersham Bioscience公司產品；圓二色譜儀：英國Applied Photophsics公司產品；熒光分光光度計：美國PerkinElmer公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 α-L-鼠李糖苷酶酶液的制備、分離和純化參照劉小琴等的實驗方法[26]，將含pPIC9K-rha重組質粒的畢赤酵母SMD1168以1%（體積分數）接種量接入30 mL YPD培養基中。培養14～16 h后，以1%（體積分數）接種量接入100 mL BMGY培養基中，于30℃、180 r/min條件下培養。當OD600為2～5時，離心收集菌體，轉移至100 mL BMMY培養基中。培養期間每隔24 h添加體積分數為0.5%的甲醇，作為碳源并誘導菌體表達。誘導表達7 d后，4℃、5 000 r/min離心15 min取上清液，即α-L-鼠李糖苷酶的粗酶液。將上清液進行超濾濃縮（相對分子質量50 000微孔濾膜）后，上樣至以20 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.0）平衡的Sephacryl S-200柱中，收集α-L-鼠李糖苷酶組分，于4℃下保存備用。

1.3.2 酶活力測定參照楊巖的實驗方法[27]，以20 mmol/L pNPR為底物測定α-L-鼠李糖苷酶酶活性。在20 mmol/L檸檬酸-磷酸鹽緩沖液（pH 4.0）中，60℃條件下，以每分鐘釋放1 μmol pNP所需的酶量為1個酶活力單位。60 μL pNPR與120 μL緩沖液在60℃孵育5 min后，加入20 μL酶液，繼續在60℃下反應10 min，加入1 mol/L Na2CO3終止反應，于410 nm處測定釋放的pNP。

實驗組為酶液與等體積山梨醇混合，山梨醇終濃度分別為0.6 mol/L和1.2 mol/L；對照組為酶液與等體積去離子水混合。

1.3.3 熱穩定性與熱失活分析作者所在實驗室前期研究發現，濃度為1.2 mol/L的山梨醇是α-L-鼠李糖苷酶酶活力增強的關鍵拐點，也是其酶活力的最大峰值處[28]。為了研究山梨醇對α-L-鼠李糖苷酶熱穩定性的具體影響，分別測定并繪制了添加1.2 mol/L山梨醇后α-L-鼠李糖苷酶的熱穩定性曲線與熱失活曲線的一級動力學模型。

熱穩定性曲線：以添加1.2 mol/L山梨醇的酶液為實驗組，于60、65、70、75、80℃溫育10 min后，按照1.3.2方法測定殘余酶活力，以最高酶活力為100%，計算相對酶活力，并繪制熱穩定性曲線。

熱失活曲線的一級動力學模型：根據熱穩定性實驗結果，選取合適溫度，按照1.3.2方法測定酶液在不同溫度下孵育不同時間的殘余酶活力，以ln（At/A0）作圖（At為殘余酶活力×100，A0為最高酶活力），并進行線性擬合，繪制熱失活曲線的一級動力學模型。得到的線性斜率即為該溫度下的熱失活常數（K），由熱失活常數可計算出該溫度下的半衰期（t1/2）。

按照1.3.2方法測定殘余酶活力，以測得最高酶活力為100%，待殘余酶活力降至50%以下，停止測定。60℃下對照組每隔2 h取樣測定殘余酶活力，實驗組每隔1 d取樣測定殘余酶活力；65℃下對照組每隔10 min取樣測定殘余酶活力，實驗組隔1 h取樣測定殘余酶活力；70℃下對照組每隔2 min取樣測定殘余酶活力，實驗組每隔10 min取樣測定殘余酶活力。

1.3.4 圓二色譜分析將分別添加0.6、1.2 mol/L山梨醇的酶液在70℃下溫育20 min作為實驗組1（0.6 mol/L）、實驗組2（1.2 mol/L），未添加山梨醇未溫育為對照組，蛋白質質量濃度為0.13 mg/mL，掃描范圍為185～260 nm，掃描速率為1 nm/s，分辨率為1 nm。分別記錄山梨醇分別添加1.2、0.6 mol/L和未添加時的圓二色譜，最后用Dichrowed分析二級結構，并計算4個二級結構：α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規則卷曲的相對含量。

1.3.5 熒光光譜分析內源熒光分析：蛋白質質量濃度為0.04 mg/mL，測量溫度為25℃，激發波長為295 nm，掃描速度為100 nm/min，激發和發射狹縫寬度均為10 nm，波長掃描范圍為300～500 nm。分別記錄α-L-鼠李糖苷酶在不同溫育時間及不同山梨醇添加量的條件下的熒光光譜。

表面疏水活性分析：8-苯胺-1-萘磺酸（8-aniline-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）為熒光探針，蛋白質質量濃度為0.2 mg/mL，測量溫度為25℃，激發波長為375 nm，掃描速度為100 nm/min，激發和發射狹縫寬度均為10 nm，波長掃描范圍為400～700 nm。分別記錄α-L-鼠李糖苷酶在不同溫育時間及不同山梨醇添加量的條件下的表面疏水活性。

樣品處理：將分別添加0.6、1.2 mol/L山梨醇的酶液在70℃下溫育20 min作為實驗組1（0.6 mol/L）、實驗組2（1.2 mol/L），未添加山梨醇未溫育為對照組，不添加山梨醇但溫育為未添加組，對α-L-鼠李糖苷酶進行熒光掃描。

1.3.6 數據處理每組實驗設3個平行，取平均值，采用GraphPad Prism 8、Excel 2019、Dichrowed軟件進行數據處理及相關圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 熱穩定性曲線

酶的熱穩定性易受到反應溫度、反應體系及其他條件的影響。在作者所在團隊前期的研究中發現黑曲霉源α-L-鼠李糖苷酶r-Rha1的最適溫度為60℃[25]，分別在60、65、70、75、80℃下測定有無山梨醇條件下該酶的熱穩定性曲線，結果如圖1所示。在60℃和65℃下，實驗組與對照組的相對酶活力無明顯差別，在70℃下對照組的相對酶活力僅為13%，而實驗組仍可保留98%的相對酶活力。由此可說明山梨醇可有效提高α-L-鼠李糖苷酶的熱穩定性，這與Pazhang等發現添加山梨醇可提高胰蛋白酶穩定性[12]的研究結果一致。

圖1 熱穩定性曲線Fig.1 Thermal stability curve

2.2 熱失活曲線

酶的熱失活是最重要的酶失活形式，熱失活曲線反應的酶失活規律是控制與設計工業酶催化反應的必要條件。圖2分別為60、65、70℃下的一級熱力學模型圖。根據圖2可計算出α-L-鼠李糖苷酶在不同條件下的熱失活常數K和半衰期t1/2，結果如表1所示。在60、65、70℃下未添加山梨醇的α-L-鼠李糖苷酶的半衰期分別為8.08 h、46.52 min、4.34 min，由此可說明α-L-鼠李糖苷酶對于溫度十分敏感。山梨醇通過維持蛋白質構象而提高酶的熱穩定性，延長半衰期，在60、65、70℃下實驗組的半衰期分別是對照組的29、25、10倍。60℃下α-L-鼠李糖苷酶本身已具有較好的熱穩定性，65℃下對半衰期的提高效果不如60℃，這符合隨著溫度的升高酶蛋白半衰期逐步下降的基本規律，也表明山梨醇能有效提高α-L-鼠李糖苷酶的半衰期，這與Ge等發現添加山梨醇可延長曲霉源α-L-鼠李糖苷酶半衰期的結果一致[24]。

表1 酶失活一級動力學模型參數Table 1 Parameters of the first-level kinetic model for enzyme inactivation

圖2 熱失活曲線的一級動力學模型Fig.2 One-level kinetic model of thermal deactivation curve

2.3 圓二色譜分析

圓二色譜可反映蛋白質的二級結構變化[29]，結果如圖3、表2所示，實驗組較對照組在192 nm處有較強的正吸收峰，α-螺旋相對含量增加，β-折疊相對含量則相應降低，無規則卷曲相對含量變化小。α-螺旋靠氫鍵維持穩定，具有一定的剛性，其比例的增加使α-L-鼠李糖苷酶的結構更加剛性。加入山梨醇可保護酶蛋白在變性過程中α-螺旋不被破壞，使α-螺旋、β-折疊和β-轉角維持合適比例和穩定的空間構象，從而提高α-L-鼠李糖苷酶的熱穩定性。

圖3 圓二色譜圖Fig.3 Circular dichroism spectrum

表2 二級結構相對含量Table 2 Secondary structure content table %

2.4 熒光光譜分析

熒光光譜普遍用于蛋白質三級結構研究，因為其內部Trp和Tyr的熒光吸收對各類擾動十分敏感，有研究者就采用熒光光譜法對外源物質與蛋白質的結構變化進行分析研究[30-31]。當Trp和Tyr所處的非極性環境轉向極性環境時，多肽鏈和氨基酸發生去折疊而舒展，酶構象發生改變，引起紅移與熒光強度降低。內源熒光結果如圖4（a）所示，對照組最大吸收波長為342 nm，實驗組中添加1.2 mol/L山梨醇最大吸收波長為344.5 nm，小于未添加及添加量為0.6 mol/L山梨醇的347 nm，紅移程度有所下降。表面疏水活性分析結果如圖4（b）所示，添加山梨醇的最大吸收波長從488 nm移至486 nm，發生輕微藍移，熒光強度高于對照組。根據前期實驗，α-L-鼠李糖苷酶中山梨醇的最佳用量為1.2 mol/L[28]，但添加0.6 mol/L山梨醇的熒光強度卻高于添加1.2 mol/L山梨醇的熒光強度。

圖4 熒光光譜Fig.4 Fluorescence chromatogram

作者所在實驗室前期對底物pNPR與α-L-鼠李糖苷酶進行分子動力學模擬，發現pNPR結合環附近的Trp253和Trp640對于底物結合十分重要[32]，在α-L-鼠李糖苷酶催化結構域的（α/α）6桶狀結構域內部所含Trp和Tyr數量也較多。一般認為，山梨醇可改善酶的熱穩定性是由于增強了酶蛋白的疏水作用和氫鍵數量[33]，且涉及催化結構域周圍的氨基酸的氫鍵對酶和底物之間的接觸貢獻最大[34]。由內源熒光光譜與表面疏水活性分析推斷，添加1.2 mol/L山梨醇的紅移程度小于添加量為0.6 mol/L山梨醇，是由于山梨醇的羥基可與水分子、Trp和Tyr側鏈形成大量氫鍵，使疏水氨基酸向內卷曲，扭轉Trp和Tyr向更親水的環境轉移，穩定蛋白質構象，進而降低紅移程度。山梨醇可在α-L-鼠李糖苷酶分子周圍形成致密水化層，減小酶蛋白在熱變性過程中的構象變化，維持蛋白質結構的穩定性。而過量山梨醇會與α-L-鼠李糖苷酶活性中心相互作用，進而阻礙酶與底物的結合，故添加0.6 mol/L山梨醇的熒光強度高于添加1.2 mol/L山梨醇的熒光強度。

山梨醇的優先水合作用降低了酶蛋白與水分子的直接相互作用，增強非極性基團間的疏水作用，營造疏水環境[35]，從而提高α-L-鼠李糖苷酶熱穩定性[36-37]，其機理圖如圖5所示。圓二色譜與熒光光譜結果顯示山梨醇對α-L-鼠李糖苷酶熱穩定性產生了影響，與其他研究人員證實山梨醇可通過改變酶蛋白的微環境來提高纖維素酶[37]、β-甘露聚糖酶[38]、α-淀粉酶[39]和β-葡萄糖苷酶[40]等的穩定性結果一致。

圖5 山梨醇提高α-L-鼠李糖苷酶熱穩定性機理圖Fig.5 Mechanism of sorbitol to improve the thermal stability of α-L-rhamnosidase

3 結語

通過分析經山梨醇處理的α-L-鼠李糖苷酶殘余酶活力及結構的變化，探究山梨醇對α-L-鼠李糖苷酶熱穩定性的影響。熱穩定性及熱失活動力學分析表明，在60～70℃下，加入山梨醇提高了α-L-鼠李糖苷酶的熱穩定性；在60、65、70℃下，加入1.2 mol/L山梨醇可分別將半衰期提高29、25、10倍。圓二色譜和熒光光譜分析表明，山梨醇可增強α-L-鼠李糖苷酶的表面疏水活性和結構剛性，從而提高其熱穩定性。作者解釋了山梨醇提高α-L-鼠李糖苷酶熱穩定性的分子作用及結構變化機制，為深入理解山梨醇提高酶蛋白穩定性的機理提供了參考；同時進一步驗證了山梨醇對增強酶類熱穩定性的普遍適用性，為提高酶熱穩定性提供了參考方法。