C端柔性區域對多糖降解菌來源的麥芽五糖生成酶冷適性的調控

丁 寧， 李才明，2，3， 班宵逢，2，3， 顧正彪*，2，3， 李兆豐*，2，3

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；2.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；3.江南大學 食品安全與質量控制協同創新中心，江蘇 無錫 214122）

地球的自然生態系統中存在諸多極端環境，能夠在極端環境下正常生長代謝的微生物被稱為極端微生物，其中，在海洋深處、極地和陸地高寒帶等低溫環境生長的微生物被稱為低溫微生物。低溫微生物通常具有與常溫微生物不同的生理機制，其中包括分泌的酶類具有較強的低溫催化能力，這類酶被稱為冷適酶[1-2]。對冷適酶進行研究，一方面能夠拓寬酶的應用范圍，一定程度上填補工業用酶的缺口；另一方面，冷適酶的分子結構通常具有特殊性，因此，發現并總結冷適酶的結構與功能關系，可以為生物學研究提供寶貴信息[3-4]。

麥芽五糖（maltopentaose，G5）是由5個葡萄糖單元以α-1，4糖苷鍵連接而成的低聚糖，因其甜度較低，在維持血糖平衡和改善腸道內環境中發揮重要作用，同時作為營養助劑和診斷試劑被廣泛應用于食品和醫藥領域，因此G5的合成具有較高的研究和應用價值[5-8]。G5主要采用酶法生產，即利用麥芽 五 糖 生 成 酶 （maltopentaose-forming amylase，G5A，EC 3.2.1.X）選擇性地水解淀粉中特定的α-1，4糖苷鍵，生成以G5為主的麥芽低聚糖混合物。目前，已報道的G5A的最適反應溫度為60～93℃[9-11]，在室溫或低溫下催化效率極低。然而，長時間加熱可能引起G5的顏色等物理性質發生變化，并且降低G5的營養性[12]；同時，高溫生產會引起大量能源消耗和溫室氣體排放。因此，冷適G5A的開發對于高效、綠色生產高品質的G5起到至關重要的作用[6]。

前期研究表明，海洋微生物多糖降解菌Saccharophagus degradans能夠分泌兩種不同相對分子 質 量 的G5As（SdG5A和SdG5A-CD），位 于SdG5A C端的淀粉結合域（starch-binding domain，SBD）可能發生降解，形成SdG5A-CD。為了探究SdG5A和SdG5A-CD的冷適性，作者分別將其表達于枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis WB600中，并對重組SdG5A和重組SdG5A-CD進行分離純化。以水解活力和G5得率為指標，分析其在低溫下的催化能力。隨后，利用RoseTTAFold預測SdG5A的結構模型，并在此基礎上通過結構分析和分子動力學模擬（molecular dynamics simulations，MD）等生物信息學手段，闡明SdG5A分子柔性與酶冷適性之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 質粒和菌株pST質粒、Escherichia coli JM109克隆菌株保存于作者所在實驗室；B.subtilis WB600感受態細胞由江南大學糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心饋贈。

1.1.2 主要試劑與材料高保真DNA聚合酶Phanta Max、重組克隆試劑盒：南京諾唯贊生物科技股份有限公司產品；Phenyl Superose HR 10/10疏水柱：美國Amersham Biosciences公司產品；Superdex 75 10/300凝膠柱：瑞典GE Healthcare Biosciences公司產品；CarboPacTMPA200碳水化合物分析柱：美國Dionex公司產品；麥芽低聚糖標準品：日本Hayashibara生物化學研究所提供。

1.1.3 主要儀器AKTA Prime Plus蛋白質純化系統：美國GE公司產品；高效陰離子交換色譜（highperformance anion-exchange chromatographic，HPAEC）儀、脈沖電流檢測器（pulsed amperometrydetector，PAD）：美國Thermo Scientific公司產品。

1.1.4 培養基LB培養基：胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉10 g/L，pH 7.0；固體培養基再添加1.5 g/dL瓊脂粉。發酵培養基：酵母粉36 g/L、麥芽糊精5 g/L，pH 6.0。

1.2 實驗方法

1.2.1 表達載體sdg5a/pST和sdg5a-cd/pST的構建SdG5A編 碼 基 因sdg5a（GenBank accession：AIV43244.1）和相關引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。利用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增sdg5a、sdg5a-cd和pST質?；蚱?，引物序列見表1。

表1 構建sdg5a/pST和sdg5a-cd/pST表達載體的引物設計Table 1 Primers used for the construction of sdg5a/pST and sdg5a-cd/pST plasmid

PCR完成后，分別在兩個基因片段中加入1 μL限制性內切酶Dpn I，于37℃酶切4 h，消化模板質粒，并進行切膠回收。參考重組克隆試劑盒說明書，完成片段的拼接，得到sdg5a/pST和sdg5a-cd/pST表達載體。

1.2.2 Bacillus subtilis WB600感受態細胞的轉化取10 μL sdg5a/pST和sdg5a-cd/pST質粒，分別加入至B.subtilis WB600超級感受態細胞（100 μL）中，于37℃搖床（200 r/min）中培養2 h，涂布于含有終質量濃度10 μg/mL卡那霉素的LB固體培養基，37℃培養過夜。挑取單菌落即為基因工程菌sdg5a/pST/B.subtilis WB600和sdg5a-cd/pST/B.subtilis WB600。

1.2.3 SdG5A和SdG5A-CD的生產和純化挑取單菌落加入到裝有5 mL LB培養基的15 mL聚丙烯圓底試管中，于37℃搖床（200 r/min）過夜培養。取2 mL活化菌液接種至含有50 mL發酵培養基的250 mL錐形瓶中，在25℃搖床（200 r/min）培養72 h。發酵結束后，將發酵液在4℃、10 000 r/min的條件下離心20 min，收集上清液即為重組SdG5A和SdG5A-CD粗酶液。LB培養基和發酵培養基中均添加終質量濃度為10 μg/mL的卡那霉素。

重組SdG5A和SdG5A-CD的純化均采用疏水柱與凝膠柱相結合的方法。在使用疏水柱純化時，首先用含有體積分數為20%（NH4）2SO4的緩沖液A（20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.0）平衡疏水柱，上樣后，分別用體積分數0～100%的緩沖液A（與超純水混合）進行梯度洗脫，并最終用超純水洗脫活性組分用于凝膠柱二步純化。在使用凝膠柱純化時，同樣用緩沖液A平衡凝膠柱，并在上樣后用超純水洗脫，收集洗脫液的活性部分即為純化重組SdG5A和SdG5A-CD。將純酶液置于10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.5）中，于4℃下透析過夜，并將純酶分裝保存于-80℃中。

1.2.4 水解活力的測定將每分鐘生成1 μmol還原糖（以葡萄糖計）所需的酶量定義為1個酶活力單位（U）。還原糖的含量利用3，5-二硝基水楊酸法測定[13]。具體方法為用C6H8O7-Na2HPO4緩沖液（50 mmol/L，pH 6.5）配制1 g/dL的可溶性淀粉溶液，加熱糊化。取900 μL底物加入100 μL適當稀釋的酶液，分別于0、25、45℃下反應15 min后，加入1 mL 3，5-二硝基水楊酸試劑。在沸水浴中顯色5 min，冷卻后加入3 mL蒸餾水，在540 nm下測定吸光度。

1.2.5 水解產物分析配置10 g/dL的蠟質玉米淀粉作為底物，分別加入2 U/g重組SdG5A和SdG5A-CD，在25℃下反應48 h，每隔12 h取樣，沸水浴30 min終止反應，離心（10 000 r/min）5 min，取上清液過0.22 μm水系超濾膜待測。利用HPAEC-PAD分析產物中各組分含量[6]。采用三元梯度程序進行洗脫（見表2），其中洗脫液A為0.25 mol/L氫氧化鈉，洗脫液B為1.0 mol/L醋酸鈉，洗脫液C為超純水。流量為0.5 mL/min，柱溫為30℃，進樣量為10 μL，以糖四電位波形檢測。

表2 HPAEC-PAD分離麥芽低聚糖的梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program for the separation of maltooligosaccharides using HPAEC-PAD

以葡萄糖、麥芽糖和麥芽低聚糖標準品為對照進行水解產物組分的定性和定量，淀粉轉化率和G5比例的計算方法如下：

式中：Cs為淀粉轉化率，%；m1為葡萄糖、麥芽糖、麥芽低聚糖總質量；m0為底物干基質量；RG5為G5比例，%；mG5為G5質量。

1.2.6 SdG5A的結構預測利用RoseTTAFold（https：//robetta.bakerlab.org/）[14]和AlphaFold2[15]模擬SdG5A的空間結構。利用M-ZDock（https：//zdock.umassmed.edu/m-zdock/）模擬SdG5A二聚體結構[16]。模擬結構的準確性和相似性利用ResQ（https：//zhanglab.ccmb.med.umich.edu/ResQ/）計算TM-score進行評價[17]。蛋白質結構作圖利用Pymol軟件進行。

1.2.7 SdG5A的柔性分析利用ResQ在線分析工具（https：//zhanggroup.org/ResQ/）分 析SdG5A的 溫度因子（B-factor）和模型到自然態之間的距離（distance to native state，dn），并以此作為評價蛋白質靜態柔性的依據[17]。利用MD計算SdG5A在不同溫度下氨基酸殘基的均方根漲落（root-mean-square fluctuation，RMSF）值，以此作為評價SdG5A動態柔性的指標。

利用Desmond軟件進行MD，溶劑模型選擇TIP3P，盒子為正交晶系，盒子大小設置為1 nm×1 nm×1 nm，角度α=90°、β=90°、χ=90°。添加Na+平衡電荷，選擇OPLS4力場進行體系構建。選擇NVT平衡，溫度設置為0℃和45℃，每個體系的模擬時間為100 ns，收集1 000幀軌跡。

1.2.8 數據處理實驗結果為3次平行實驗的平均值，采用平均值±標準偏差表示。利用Prism 8 Student’s T-test分析兩組間的顯著性差異。當P＜0.05時，認為組間差異具有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 Linker-SBD對SdG5A冷適性的影響

2.1.1 SdG5A和SdG5A-CD的 純 化SdG5A與SdG5A-CD含有相同的催化域（Q1～A427），SdG5A在C端含有額外的SBD（V446～F542），位于N端的催化域與C端的SBD之間以linker（I428～K445）連接（見圖1（a））。SdG5A和SdG5A-CD的理論相對分子質量分別為58 000和48 000。重組SdG5A和SdG5A-CD均采用疏水-凝膠兩步法進行純化，經十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）驗證，所收集活性部分的相對分子質量與理論相對分子質量相同（見圖1（b））。

圖1 SdG5A和SdG5A-CD的結構組成和SDS-PAGE分析Fig.1 Structural composition and SDS-PAGE analysis of SdG5A and SdG5A-CD

2.1.2 SdG5A和SdG5A-CD的冷適性為了評價SdG5A和SdG5A-CD的冷適性，分別測定了其在冰點（0℃）、室溫（25℃）和最適反應溫度（45℃）下的水解活力，結果如表3所示，SdG5A在0℃和25℃下可分別保持最高比活力27.8%和64.0%的水解活力，說明其具有較強的冷適性；而SdG5A-CD在0℃下的比活力僅為野生型的2.7%，在25℃下的比活力僅為45℃下的26.7%，說明linker-SBD結構的缺失導致SdG5A的冷適性大幅下降。來源于鹽浮交替單胞菌（Alteromonas haloplanctis）A23的α-淀粉酶（AHA）是最早發現、目前研究最多的冷適α-淀粉酶，其最適溫度為25℃，在0℃下的催化活力為最適溫度下20%[18]。與AHA相比，SdG5A在0℃下的相對活力高于AHA，說明其具有良好的應用前景。

表3 SdG5A和SdG5A-CD在不同溫度下的比活力Table 3 Specific activities of SdG5A and SdG5A-CD oct different temperature

為了探究SdG5A和SdG5A-CD在室溫下制備G5的效率，評價其應用可行性，以10 g/dL的蠟質玉米淀粉為底物，在25℃下反應0～48 h，利用HPAEC-PAD分析水解產物，并計算淀粉轉化率和G5比例，結果如圖2所示。結果表明，當SdG5A與蠟質玉米淀粉反應24 h時，G5得率（G5比例與淀粉轉化率的乘積）高達48.6%；然而當反應時間延長至48 h時，由于SdG5A發生了過度水解反應，產物中的G5被進一步降解為聚合度更低的小分子糖，導致G5得率降低（見圖2（a））。相比之下，由于SdG5A-CD在25℃下的水解活力較低，并且產物特異性較差，其水解蠟質玉米淀粉生產G5的最高得率僅為SdG5A的9.5%，因此，SdG5A在室溫下制備G5的效率更高。此前，韓煦利用巨大芽孢桿菌（B.megaterium）來源的G5A突變體水解20 g/dL的木薯淀粉，在40℃下反應36 h，可以獲得的最高G5得率為39.0%[19]。相比而言，利用SdG5A制備G5不僅得率更高，同時反應在室溫下進行，能夠降低加熱和冷卻處理所引起的對產品和環境的不利影響，因此，SdG5A更適合用于G5的高效、綠色生產。

圖2 SdG5A和SdG5A-CD在25℃下水解蠟質玉米淀粉生產G5的淀粉轉化率和G5比例Fig.2 Conversion rate and ratio of G5 arising from the hydrolyzation of waxy corn starch at 25℃by SdG5A and SdG5A-CD

2.2 SdG5A的空間結構

相比于SdG5A-CD，SdG5A具有較強的冷適性，說明SdG5A的linker-SBD結構對調控其冷適性具有重要作用。為了加深對SdG5A冷適性機制的理解，需要進一步獲取其結構信息。然而，目前對SdG5A晶體結構的獲取難度較大。一方面，SdG5A與已報道的蛋白質的同源性均較低，這使其無法通過同源模型化的方法對結構進行解析和預測。在已報道序列的蛋白質中，SdG5A與來源于海洋微生物Marinagarivorans algicola的淀粉酶（GenBank accession WP_053982064）同源性最高，序列相似度為67%[6]；在已報道晶體結構的蛋白質中，SdG5A與來源于Pseudoalteromonas haloplanktis的淀粉酶（PDB ID：1G9H）的同源性最高，序列相似度為51%，但該酶不存在SBD結構，因此無法為SdG5A完整結構的解析和預測提供依據。另一方面，由于SBD的柔性過大，在溶液中呈高度無序性，且結構不穩定，在蛋白質結晶過程中易發生降解，導致包括SdG5A在內的麥芽低聚糖生成酶均無法通過X射線衍射的方法獲得含有SBD的完整結構信息[20-21]。2021年7月，谷歌Deepmind團隊和華盛頓大學David Baker團隊分別發布了新型蛋白質結構預測工具AlphaFold2和RoseTTAFold[14-15]，該成果突破性地提高了蛋白質結構預測的準確性，同時也為本研究中獲得SdG5A完整結構提供重要工具。

分 別 利 用RoseTTAFold和AlphaFold2對SdG5A的空間結構進行預測，結果如圖3所示。利用ResQ計算單一結構的TM-score，可評價模擬結構的準確性，在0～1.00時，分值越高說明模擬結構越 準 確[17]。RoseTTAFold和AlphaFold2模 擬 的SdG5A結構的TM-score分別為0.71和0.65，說明RoseTTAFold模擬結構的準確性略高于AlphaFold2。利用ResQ同時計算兩個結構的TMscore，可評價兩個結構的相似性，若分值在0.50～1.00說明其具有相同的折疊方式[17]。RoseTTAFold與AlphaFold2模擬結構的TM-score為0.78，說明二者的相似度較高。盡管利用RoseTTAFold和AlphaFold2模擬得到的SdG5A結構中結構域內部的折疊基本相同，但SBD的空間位置卻明顯不同（見圖3）。在RoseTTAFold模擬結構中，結構域的排列方式較為緊湊，SBD與催化位點相靠近；而在AlphaFold2模擬結構中，結構域的排列方式較為松散，SBD遠離催化位點。

圖3 SdG5A空間結構的預測Fig.3 Prediction of SdG5A spatial structures

為了明確SBD的位置，分析了兩個模擬結構中結構域之間的相互作用（見圖4）。結果表明，在AlphaFold2模擬結構中，SBD與催化域之間不存在相互作用；但在RoseTTAFold模擬結構中，催化域、linker和SBD之間存在大量氫鍵相互作用，這些作用力使得RoseTTAFold模擬結構的整體構象更加緊湊，有利于SBD發揮向催化域遞送底物的作用[22]。

圖4 RoseTTAFold模擬結構中催化域、SBD和linker之間的相互作用力Fig.4 Schematic diagram of the interactions within catalytic domain，SBD and linker in the structure predicted by RoseTTAFold

SdG5A的表面電荷分析結果表明，其催化域中的堿性氨基酸殘基的比例高于酸性氨基酸殘基，使其整體帶正電荷，凈電荷密度（堿性氨基酸殘基數目與酸性氨基酸殘基數目的差值占總氨基酸殘基數目的比例）為+6.1%；而在SBD中，酸性氨基酸殘基的比例高于堿性氨基酸殘基，使其整體帶負電荷，凈電荷密度為-4.1%[6]。由于催化域和SBD帶相反電荷，因此存在一定的靜電引力，這可能是RoseTTAFold模擬結構中催化域與SBD互相靠近的另一個原因。但氫鍵具有方向性，而靜電力不具有方向性，因此，產生這種構象的主要原因仍然是催化域與SBD之間的氫鍵相互作用。

Jorgensen等利用小角衍射觀察到Aspergillus niger葡萄糖淀粉酶（glucoamylase，EC 3.2.1.3）可以在溶液中形成“頭對尾”的二聚體結構，這種結構可以促使SBD向催化域靠近，而不必依賴于linker的運動調整催化域和SBD的相對位置[23]。相應地，對于整體構象較為松散的AlphaFold2模擬結構，也可能通過形成二聚體獲得更加緊湊的構象，從而使SBD靠近催化位點。以AlphaFold2模擬的SdG5A結構（見圖3（b））為模板，利用M-ZDock模擬SdG5A的二聚體結構。由圖5（a）中可以看出，SdG5A的二聚體同樣呈現出“頭對尾”的結構，其中一個單體的SBD靠近于另一個單體的催化位點。將該二聚體結構與RoseTTAFold模擬結構疊加，發現后者的SBD與前者其中一個單體的SBD的位置接近 （見圖5（b））。該結果說明，RoseTTAFold和AlphaFold2所模擬的SdG5A結構均可被認為是準確的，二者的區別在于RoseTTAFold所模擬的是SdG5A呈單體時的構象，而AlphaFold2所模擬的是SdG5A呈二聚體時的構象。

圖5 SdG5A二聚體空間結構的預測Fig.5 Structure prediction of dimeric SdG5A

為了判斷SdG5A形成二聚體的可能性，分別利用Native-PAGE和SDS-PAGE分析SdG5A在非變性和變性條件下的相對分子質量（見圖6），結果表明，兩種方法測得的SdG5A相對分子質量一致，說明SdG5A在溶液中以單體形式存在，因此，RoseTTAFold模擬的SdG5A結構更加準確。

圖6 SdG5A的變性電泳與非變性電泳分析Fig.6 SDS-PAGE and Native-PAGE analysis of SdG5A

為了進一步驗證RoseTTAFold模擬結構的準確性，以來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌（B.stearothermophilus）的麥芽糖α-淀粉酶（maltogenic α-amylase，EC 3.2.1.133，BstA）的 晶 體 結 構（PDB ID：1QHP）為參考結構[24]，與SdG5A模擬結構進行比對。一方面，BstA的功能與SdG5A相似，二者均能夠水解淀粉的α-1，4糖苷鍵，特異性地生成某一種聚合度的產物；另一方面，BstA的結構組成與SdG5A相似，二者在C端均含有SBD。通過疊加SdG5A模擬結構與BstA晶體結構發現，兩個結構中SBD的位置幾乎完全相同 （見圖7），說明RoseTTAFold模擬結構的可信度較高。

圖7 SdG5A模擬結構與BstA晶體結構的比對Fig.7 Alignment of the predicted structure of SdG5A and the crystal structure BstA

2.3 SdG5A的柔性分析

在低溫條件下，蛋白質的分子熱運動較低，不利于酶對底物分子的獲取。因此，通過提高蛋白質的整體或局部柔性來增強分子熱運動，可以有效提高冷適酶在低溫下的催化效率。蛋白質柔性可以通過B-factor、dn和RMSF進行評價，其中，B-factor是衡量原子位置不確定性的一種指標，反映了晶體中原子電子密度的模糊度[25]；dn是衡量原子不穩定性的一種指標，當原子處于能量最低、最穩定的自然態時，dn數值為0[17]；RMSF是衡量原子運動自由程度的指標，可以利用MD計算一定時間范圍內每個原子相對于其平均位置的變化幅度而獲得。B-factor和dn反映的是蛋白質結構的靜態柔性，而RMSF反映的是動態柔性。B-factor、dn和RMSF的數值越大，說明相應區域的柔性越高。

2.3.1 SdG5A的靜態柔性利用ResQ分析SdG5A的靜態柔性，包括B-factor（見圖8（a））和dn（見圖8（b）），并利用Pymol將SdG5A的B-factor映射到其空間結構（見圖8（c））。

圖8 SdG5A的靜態柔性分析Fig.8 Analysis of the static flexibility of SdG5A

由圖8（a）和圖8（c）可知，linker區域的Bfactor值明顯高于催化域和SBD；從圖8（b）可知，linker和SBD區域的dn值均高于催化域，說明linker中原子位置的不確定性導致了linker-SBD區域中原子位置的不穩定性，即高度靈活的linker可能帶動了SBD的運動。

2.3.2 SdG5A的動態柔性在0℃和45℃下分別運行MD，當體系運行至100 ns后，蛋白質分子的均方根偏差介于0.5～0.6 nm，說明此時SdG5A結構趨于穩定。SdG5A的RMSF曲線如圖9（a）所示。結果表明，在45℃下蛋白質整體結構柔性較高；當溫度降低至0℃時，催化域中的氨基酸殘基的RMSF發生不同程度的降低，而linker-SBD區域的RMSF未發生明顯變化，說明linker-SBD區域的柔性受溫度影響較小，且在0℃下仍然能夠保持較高的柔性。比較0℃下不同時刻SdG5A的整體構象發現，催化域的中心結構域在100 ns內未發生明顯位移，而SBD可以在較大的空間范圍內擺動（見圖9（b））?？紤]到SBD具有捕獲底物的能力[22]，linker-SBD結構高柔性的分子特征有利于提高其在低溫下捕獲底物的效率，從而提高酶的催化活力。以上結果闡明了SdG5A和SdG5A-CD的冷適性存在差異的原因，并揭示了調控SdG5A冷適性的重要結構基礎。

圖9 MD分析SdG5A的動態柔性Fig.9 MD analysis of the dynamic flexibility of SdG5A

3 結語

目前已報道的G5A均為高溫酶，為了維持其酶反應體系的溫度，需要消耗大量的能源、排放大量的溫室氣體，并且產品的營養價值和感官品質會受到高溫的影響而降低。為了解決上述問題，一方面可以加強對冷適G5A的開發和應用；另一方面可以挖掘和總結冷適G5A的結構特征，對非冷適G5A進行定向改造。為了實現上述目標，作者以SdG5A和SdG5A-CD為研究對象，通過異源表達體系的構建、冷適性的表征、空間結構的模擬和分子柔性的分析，證明了SdG5A在室溫下生產G5的可行性，并揭示了linker-SBD結構高柔性的分子特征對調控酶冷適性的關鍵作用，可為其他淀粉酶分子改造的理性設計提供參考，為G5的高效、綠色合成提供理論基礎。