京尼平衍生物的合成及其抗類風濕關節(jié)炎活性

柯江濤, 何 格, 李 志, 董心同, 陳芳園, 甘珮榮, 吳 虹*

(1. 安徽中醫(yī)藥大學藥學院,安徽 合肥 230012; 2.新安醫(yī)學教育部重點實驗室 中藥研究與開發(fā)安徽省重點實驗室,安徽 合肥 230012)

類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis, RA)是一種慢性炎癥性關節(jié)疾病,其病理特征為滑膜炎性增生、關節(jié)破壞和骨損傷等[1-2]。RA目前無藥物可根治,通常需終身治療以減輕癥狀[3]。臨床上用于治療RA的藥物主要有甾體激素類藥物、非甾體抗炎藥、病情緩解抗風濕藥物和生物制劑等。甲氨蝶呤(Methotrexate, MTX)是目前一線病情緩解抗風濕藥物,但其半衰期短,且存在肝毒性、肺炎和肺纖維化等副作用[4]。盡管當前抗RA藥物在不斷發(fā)展,但現(xiàn)有藥物均存在較嚴重的不良反應,故仍需尋找高效低毒的藥物治療RA緩解炎癥、改善關節(jié)軟骨和骨破壞癥狀。

Scheme 1

GEP為清熱解毒中藥梔子有效成分梔子苷(Geniposide, GE)水解后的苷元部分,屬于環(huán)烯醚萜類[5-6]。近年來,已有文獻報道證實GE及GEP均具有抗炎、抗過敏及免疫抑制等多種藥理活性[7]。GE在體內被腸道β-D-葡萄糖苷酶水解成GEP,后者主要通過抑制NF-κB/IKB-β降解,減少炎癥反應過程中前列腺素E2(Prostaglandin, PGE2)和NO的生成,從而顯著改善RA患者的癥狀[8-9]。然而GEP吡喃環(huán)上C-3位的羥基和C-10位的羥基極性較大,使其脂溶性降低,難以透過血-關節(jié)囊液屏障(Blood-joint barrier, BJB)運輸至關節(jié)滑膜組織內發(fā)揮作用,故其在大鼠體內的生物利用度極低。據此,對GEP進行結構修飾,以提升其脂溶性具有重要意義。

在分子中引入螺環(huán)片段可調節(jié)化合物的理化性質,同時,相比于開鏈結構,螺環(huán)具有更優(yōu)的代謝穩(wěn)定性[10-11]。為此,本文以GEP為先導化合物,并通過在C-10位以螺環(huán)為Linker片段引入不同的親脂性基團改善GEP的脂溶性。為初步驗證該設計的合理性,本文以GEP為起始原料,依次經C-3位的選擇性乙基化得3-乙基京尼平(2),后者與CDI縮合、2,6-二氮雜螺[3,3]庚烷-2-羧酸叔丁酯半草酸鹽成氨基甲酸酯脫Boc得化合物5。化合物5分別與正己酸、環(huán)丙酸和苯甲酸縮合成酰胺得化合物6a～6c;與特戊酰氯縮合得目標化合物6d(Scheme 1),其結構經HR-MS(ESI),1H NMR和13C NMR確證。通過CCK-8法測定目標化合物對人類風濕關節(jié)炎成纖維滑膜細胞(Human rheumatoid arthritis synovial cells, MH7A)增殖作用的影響。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ZF-7型三用紫外分析儀; Bruker 400 MH型超導核磁共振儀(DMSO-d6,TMS為內標);Esquire-LC-00075型液質聯(lián)用質譜儀;MSS型全波長酶標儀; Eppendorf型移液器。

京尼平、乙醇、二氯甲烷(DCM)、三乙胺(TEA)、甲苯、N,N-羰基二咪唑(CDI)、 2,6-二氮雜螺[3.3]庚烷-2-羧酸叔丁酯半草酸鹽、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、三氟乙酸(TFA)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)、 1-羥基苯并三唑(HOBT)、N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)、正己酸、環(huán)丙烷羧酸、苯甲酸、特戊酰氯,分析純或化學純;甲氨蝶呤(MTX)、胎牛血清(FBS,德國Serana公司);DMEM高糖培養(yǎng)基(武漢塞維爾生物科技有限公司);CCK-8檢測試劑盒(上海陶術生物科技有限公司)。

1.2 合成

(1) 化合物2的合成

將京尼平1.00 g(4.42 mmol)溶于乙醇(20.00 mL)中,冰浴下加入一滴濃鹽酸,置于80 ℃攪拌反應(TLC監(jiān)測反應進程)。反應完畢,用飽和碳酸氫鈉溶液調pH至7～8,依次用水(3×10.00 mL)、飽和食鹽水(3×10.00 mL)洗滌,乙酸乙酯(3×20.00 mL)萃取,合并有機相,無水硫酸鈉干燥,減壓濃縮,殘余物經硅膠柱層析[洗脫劑:石油醚 ∶乙酸乙酯=4 ∶1,V∶V]純化得1.06 g淡黃色油狀液體2,產率94.3%, MS(ESI)m/z: 255.1{[M+H]+}。

(2) 化合物3的合成

將化合物21.06 g(4.20 mmol)溶于甲苯(20.00 mL)中,依次加入N,N-羰基二咪唑2.73 g(16.80 mmol)、三乙胺1.34 mL(9.66 mmol),置于55 ℃下攪拌反應(TLC監(jiān)測反應進程)。反應完畢,在冰浴下緩慢滴加飽和碳酸氫鈉溶液溶液淬滅反應至無氣泡產生,依次用水(3×10.00 mL)、飽和氯化鈉溶液(3×10.00 mL)洗滌,乙酸乙酯 (3×20.00 mL) 萃取,合并有機相,無水硫酸鈉干燥,減壓濃縮,干燥后直接用于下一步反應,MS(ESI)m/z: 349.1{[M+H]+}。

(3) 化合物4的合成

將化合物31.46 g(4.20 mmol)溶于DMF(20.00 mL)中,依次加入2,6-二氮雜螺[3.3]庚烷-2-羧酸叔丁酯半草酸鹽2.45 g(5.04 mmol)和三乙胺2.40 mL(16.80 mmol),室溫攪拌反應(TLC監(jiān)測反應進程)。反應完畢,依次用飽和碳酸氫鈉溶液(3×20.00 mL)、水(3×20.00 mL)、飽和食鹽水(3×20.00 mL)洗滌,乙酸乙酯 (3×30.00 mL)萃取,合并有機相,無水硫酸鈉干燥,減壓濃縮,殘余物經硅膠柱層析[洗脫劑:石油醚 ∶乙酸乙酯=2 ∶1,V∶V]純化得1.79 g淡黃色固體4,產率89.0%, MS(ESI)m/z: 479.2{[M+H]+}。

(4) 化合物5的合成

將化合物4692.00 mg(1.45 mmol)溶于二氯甲烷(8.00 mL)中,冰浴下緩慢滴加三氟乙酸(2.00 mL)后移至室溫攪拌反應(TLC監(jiān)測反應進程)。反應完畢,向體系中滴加飽和碳酸氫鈉溶液調pH至近中性,依次用水(3×10.00 mL)、飽和食鹽水(3×10.00 mL)洗滌、二氯甲烷萃取(3×20.00 mL),合并有機相,無水硫酸鈉干燥,減壓濃縮,干燥后直接用于下一步反應。

(5)6a～6c的合成

將有機羧酸(2.18 mmol)、 1-(3-二甲氨基丙基)3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽418.00 mg(2.18 mmol)和1-羥基苯并三唑295.00 mg(2.18 mmol)依次溶于二氯甲烷(10.00 mL)中,攪拌下反應1 h;加入化合物5547.40 mg(1.45 mmol)和三乙胺1006.00 μL(7.25 mmol),攪拌反應至終點(TLC監(jiān)測反應進程)。反應完畢,依次用飽和碳酸氫鈉溶液(3×20.00 mL)、水(3×20.00 mL)、飽和食鹽水(3×20.00 mL)洗滌,乙酸乙酯(3×30.00 mL)萃取,合并有機相,無水硫酸鈉干燥,減壓濃縮,殘余物經硅膠柱層析[洗脫劑:石油醚 ∶乙酸乙酯=3∶1,V∶V]純化得目標化合物6a～6c。

((1R, 4aS, 7aS)-1-乙氧基-4-(甲氧羰基)-1,4a,5,7a-四氫環(huán)戊烷[c]吡喃-7-基)甲基6-己基-2,6-二氮螺環(huán)[3.3]庚烷-2-羧酸酯(6a): 529.00 mg棕色固體,產率76.6%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.50(s, 1H), 5.78(s, 1H), 4.72～4.61(m, 2H), 4.60～4.49(m, 1H), 4.26～3.91(m, 8H), 3.92～3.80(m, 1H), 3.67～3.55(m, 4H), 3.08～2.97(m, 1H), 2.77～2.66(m, 1H), 2.58～2.50(m, 1H), 2.10～1.97(m, 1H), 1.97(t,J=8.0 Hz, 2H), 1.43(p,J=7.4 Hz, 2H), 1.29～1.17(m, 4H), 1.15(t,J=8.0 Hz, 3H), 0.85(t,J=8.0 Hz, 3H);13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 172.53, 167.36, 155.90, 152.51, 139.36, 128.90, 110.71, 101.22, 65.36, 62.69, 59.86, 57.79, 51.53, 46.19, 38.75, 35.50, 32.39, 31.40, 30.96, 24.29, 22.38, 15.42, 14.31; HR-MS(ESI-TOF)m/z: Calcd for C25H37N2O7{[M+H]+}477.2693, found 477.2698。

((1R, 4aS, 7aS)-1-乙氧基-4-(甲氧羰基)-1,4a,5,7a-四氫環(huán)戊烷[c]吡喃-7-基)甲基6-(環(huán)丙烷羰基)-2,6-二氮螺環(huán)[3.3]庚烷-2-羧酸酯(6b): 538.00 mg淡黃色固體,產率83.0%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.50(s, 1H), 5.78(s, 1H), 4.71～4.63(m, 2H), 4.55(d,J=16.0 Hz, 1H), 4.36(s, 2H), 4.09(s, 4H), 3.97(s, 2H), 3.91～3.82(m, 1H), 3.66～3.60(m, 4H), 3.07～2.98(m, 1H), 2.77～2.67(m, 1H), 2.58～2.52(m, 1H), 2.11～1.99(m, 1H), 1.52～1.42(m, 1H), 1.16(d,J=8.0 Hz, 3H), 0.71～0.64(m, 4H);13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 172.99, 167.36, 155.92, 152.52, 139.36, 128.92, 110.72, 101.23, 89.35, 65.36, 62.70, 59.78, 58.04, 55.38, 51.53, 46.19, 38.76, 35.51, 32.58, 15.42, 10.03, 7.13; HR-MS(ESI-TOF)m/z: Calcd for C23H31N2O7{[M+H]+}447.2123, found 447.2129。

((1R, 4aS, 7aS)-1-乙氧基-4-(甲氧基羰基)-1,4a,5,7a-四氫環(huán)戊烷[c]吡喃-7-基)甲基6-苯甲酰基-2,6-二氮螺環(huán)[3.3]庚烷-2-羧酸酯(6c): 505.00 mg淡黃色固體,產率72.1%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.63～7.57(m, 2H), 7.54～7.41(m, 4H), 5.78(s, 1H), 4.70～4.61(m, 2H), 4.59～4.50(m, 1H), 4.44(s, 2H), 4.19(s, 2H), 4.09(s, 4H), 3.93～3.78(m, 1H), 3.68～3.56(m, 4H), 3.07～2.98(m, 1H), 2.77～2.66(m, 1H), 2.58～2.51(m, 1H), 2.09～2.00(m, 1H), 1.15(d,J=8.0 Hz, 3H);13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 169.24, 167.36, 155.89, 152.52, 139.37, 133.52, 131.45, 128.87, 128.13, 110.72, 101.22, 65.36, 62.97, 62.69, 58.82, 55.39, 51.53, 46.19, 38.75, 35.50, 33.11, 15.42; HR-MS(ESI-TOF)m/z: Calcd for C26H31N2O7{[M+H]+}483.2123, found 483.2130。

(6) ((1R,4aS,7aS)-1-乙氧基-4-(甲氧羰基)-1,4a,5,7a-四氫環(huán)戊烷[c]吡喃-7-基)甲基6-新戊酰-2,6-二氮螺環(huán)[3.3]庚烷-2-羧酸酯(6d)的合成

將化合物5143.80 mg(0.38 mmol)溶于DMF(4.00 mL)中,依次加入特戊酰氯94.00 μL(0.76 mmol)和DIPEA 182.00 μL(1.03 mmol),室溫攪拌反應(TLC監(jiān)測反應進程)。反應完畢,反應液用乙酸乙酯(3×20.00 mL)萃取,合并有機相,依次用飽和碳酸氫鈉溶液(3×10.00 mL)、水(3×10.00 mL)、飽和食鹽水(3×10.00 mL)洗滌、無水硫酸鈉干燥,減壓濃縮,殘余物經硅膠柱層析[洗脫劑:石油醚 ∶乙酸乙酯=1 ∶1,V∶V]純化得112.30 mg淡黃色固體,產率65.0%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.50(s, 1H), 5.81～5.74(m, 1H), 4.71～4.62(m, 2H), 4.59～4.42(m, 3H), 4.06(s, 5H), 4.00～3.91(m, 2H), 3.93～3.78(m, 1H), 3.69～3.55(m, 3H), 3.06～2.99(m, 1H), 2.76～2.68(m, 1H), 2.57～2.53(m, 1H), 2.09～2.00(m, 1H), 1.15(d,J=8.0 Hz, 3H), 1.08(s, 9H);13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 176.62, 167.36, 155.89, 152.52, 139.38, 128.88, 110.71, 101.23, 65.36, 62.68, 51.54, 46.19, 38.75, 38.37, 35.51, 32.84, 31.62, 30.28, 27.44, 15.43; HR-MS(ESI-TOF)m/z: Calcd for C24H35N2O7{[M+H]+}463.2435, found 463.2441。

1.3 目標化合物體外抗類風濕關節(jié)炎活性

(1) 細胞培養(yǎng)

在溫度37 ℃下,將人類風濕關節(jié)炎成纖維滑膜細胞株MH7A置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基, 5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),用含10 ng/mL的重組人TNF-α刺激MH7A。按1×104個/孔的密度接種于96孔板中,培養(yǎng)24 h,待其完全貼壁后備用。

(2) CCK-8法測定化合物對MH7A的增殖抑制作用

待測京尼平衍生物用DMSO溶解,配置濃度為1×10-2mol/L的溶液,用含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋50倍備用。取100 μL稀釋好的待測樣品加入上述96孔板中,空白對照組加入等量含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基溶液,每組設置6個復孔,置37 ℃, 5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后,每孔加入10 μL的CCK-8溶液繼續(xù)避光培養(yǎng)2～4 h,觀察孔中顏色由黃變橙后,用酶標儀測定450 nm波長下的吸光度值(OD),以MTX為陽性對照。根據OD值計算化合物對細胞的抑制率,結果見表1。

表1 目標化合物對MH7A增殖的抑制活性a

化合物6a～6d在200 μmol/L下對MH7A的增殖抑制率如表1所示。由表1可知,6a對TNF-α誘導的炎性MH7A細胞具有良好的抗增殖活性,其抑制率為75.81%,在相同測試條件下,與陽性藥(MTX)抑制活性相當。當其正戊基被替換為環(huán)丙基(6b)、苯基(6c)和特戊酰基(6d)時活性下降,抑制率分別為48.73%、 64.24%和50.86%。初步的構效關系研究表明,化合物親脂性越強,對MH7A細胞的抗增殖活性越強。如前所述,目標化合物對MH7A細胞均具有一定的抗增殖作用,其中化合物6a的抗增殖活性最強,值得進一步優(yōu)化。

以GEP為先導化合物,通過在C-10位以螺環(huán)為Linker片段引入不同的親脂性基團的方式,設計并合成了4個目標化合物(6a～6d)。目標分子對MH7A的抗增殖活性測試結果表明,6a活性最優(yōu),在200 μmol/L下對MH7A的抑制率為75.81%,與MTX相當,具有進一步優(yōu)化價值。在后續(xù)工作中,擬通過豐富螺環(huán)Linker與末端脂溶性基團的結構多樣性,對該結構類型的目標分子開展深入的構效關系研究,以獲得活性更優(yōu)的化合物用于抗RA生物學評價。