血管生成素樣蛋白8對糖尿病幼鼠成年后血糖和胰島功能的影響#

田書云 張迪 李美蕖 林昱辰 吳愛宇 周鑫宇

（1. 德州學(xué)院護理學(xué)2020級，山東 德州 253023；2. 德州學(xué)院護理系，山東 德州 253023）

糖尿病是一種多種原因引起的代謝紊亂綜合征，主要癥狀體現(xiàn)在血糖升高和脂代謝紊亂。最新調(diào)查資料顯示，在糖尿病患病人群中，18歲以下糖尿病病患已達到所有糖尿病患者人數(shù)的10%，并且每年還在以近10% 的幅度上升[1]。在1型、2型糖尿病病程中，胰島功能進行性減退和胰島β細胞數(shù)量的減少是糖尿病發(fā)展的重要致病環(huán)節(jié)；早期維護和恢復(fù)胰島殘存β細胞的數(shù)量和功能，將有助于延緩糖尿病合并癥的發(fā)生，徹底治愈糖尿病。

血管生成素樣蛋白8（Angiopoietin-like protein 8，ANGPTL8）又被稱為促胰島生長素（Betatrophin）、肝細胞癌生長因子-TD26、脂蛋白酶（Lipasin），2013年由Peng及其同事發(fā)現(xiàn)并命名[2]，具有促進胰島β細胞增殖，改善糖耐量和減少甘油三酯（Triglyceride，TG）清除的作用，有望成為治療代謝綜合征和糖尿病的藥物[3]。angptl8基因參與編碼一種在哺乳動物物種中高度保守的198-氨基酸蛋白，在小鼠和人類中，cDNA轉(zhuǎn)錄基本是相同的[4]。大量臨床研究表明，ANGPTL8水平在肥胖個體、孕婦[5]、1型糖尿病（Type 1 diabetes，T1DM）[6]、2型糖尿病（Type 2 diabetes，T2DM）和糖尿病視網(wǎng)膜病變[7，8]中均顯著升高,說明ANGPTL8對胰島素水平升高的代償機制有影響。

本文擬探究ANGPTL8對STZ誘導(dǎo)的新生糖尿病大鼠早期血糖、β細胞增殖和再生的作用，以及早期給予ANGPTL8治療對成年大鼠的糖耐量和胰島形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與試劑

SPF級、健康成年懷孕雌性Wistar大鼠5只；血管生成素樣蛋白（ANGPTL8）購于美國Greative Bio Mart公司，STZ購于美國Sigma公司。

1.1.2 儀器

低溫冷凍離心機購于德國Eppendorf公司；石蠟切片機購于德國Leica公司；

凝膠成像系統(tǒng)購于美國UVP公司；酶標(biāo)儀購于美國Bio-Rad公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒購于湖北武漢云克隆科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物造模與分組

選取懷孕15 d的SPF級健康成年Wistar大鼠5只，體重275.4±10.1 g，在溫度22℃-24℃、濕度55%±20% 的無特定病原體條件下飼養(yǎng)，保證12 h的明暗循環(huán)、常規(guī)飼養(yǎng)至幼鼠出生。

幼鼠出生后立即隨機分為糖尿病模型組（STZ組，n=13）、ANGPTL8治 療 組（STZ+ANGPTL8組，n=11）、對照組（NS組，n=13）以及ANGPTL8對照組（NS+ANGPTL8組，n=18）。STZ組與STZ+ANGPTL8組幼鼠腹腔注射STZ 0.1 g?kg-1建立糖尿病模型，NS組與NS+ANGPTL8組腹腔注射等體積生理鹽水；造模3 d后血糖升至20 mM左右視為造模成功。STZ+ANGPTL8組與NS+ANGPTL8組幼鼠2 d到6 d腹腔注射ANGPTL8 0.3 mg?kg-1進行早期治療。

1.2.2 測量幼鼠體重、血糖和血漿胰島素水平

幼鼠出生后連續(xù)7 d測量體重，使用血糖儀測量隨機血糖。在幼鼠出生后到第10 w，每周測量血糖并記錄。第10 w處死大鼠，在大鼠處死前測量體重，處死后迅速采集大鼠內(nèi)眥血液標(biāo)本，每只約1.5 mL，采用酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）通過配制標(biāo)準(zhǔn)品，酶標(biāo)板內(nèi)分別在標(biāo)準(zhǔn)品孔和待測樣品孔加入標(biāo)準(zhǔn)液與待測樣品，隨后進行三次洗滌、溫箱孵育，最后加入終止液并用酶標(biāo)儀450 nm波長檢測吸光度計算出待測血漿的胰島素水平。

1.2.3 蛋白免疫印記分析（Western blot）

出生后第7 d，STZ組取3只幼鼠，STZ+ANGPTL8組取5只幼鼠，NS組取8只幼鼠，NS+ANGPTL8組取8只幼鼠使用腹腔注射戊巴比妥鈉(0.05 g?kg-1)麻醉并處死，取胰腺組織。首先使用BCA法提取樣本總蛋白，再用Western Blot法檢測胰腺組織Pdx-1，Bcl-2和Bax蛋白水平，一抗包括1:4 000稀釋的兔抗PDX - 1、1:4 000稀釋的兔抗Bcl - 2、1:10 000稀釋的兔抗Bax和1:2 000稀釋的兔抗β微管蛋白。二抗以1:8 000比例稀釋。用ECL化學(xué)發(fā)光液顯色，使用凝膠成像系統(tǒng)Quantity One軟件測定蛋白相對濃度。

1.2.4 葡萄糖耐量實驗（Intraperitoneal Glucose Tolerance Test，IPGTT）

幼鼠成年第10w對各組第二批大鼠禁食12個小時，進行IPGTT實驗，腹腔注射葡萄糖(2 g?kg-1)后0、15、30、60和120分鐘，尾尖取血，使用血糖儀檢測血糖濃度，制作折線圖，并求曲線下面積。

1.2.5 胰腺免疫組化

幼鼠出生后成年第10w對各組第二批大鼠（STZ組，n=6；STZ+ANGPTL8，n=6；NS組，n=5；NS+ANGPTL8組，n=10）使用腹腔注射戊巴比妥鈉（0.05 g?kg-1）麻醉處死，取胰腺組織，石蠟包埋后，切片成5 μm組織切片。用蘇木精-伊紅進行HE染色觀察胰腺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及胰島完整性。用抗胰島素一抗（ZSGB - BIO）孵育過夜。然后用二抗標(biāo)記，PBS清洗，固定后高倍鏡下胰島素染色。每個切片中至少有6個隨機胰島（放大，×400）被計數(shù)為胰島素陽性區(qū)域。使用Image J軟件將β細胞面積比率量化為胰島素陽性細胞面積除以總組織面積。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS20.和Graph Pad Prism 8.0對數(shù)據(jù)進行分析，所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（One way ANOVA）進行組間比較，P＜0.05認(rèn)為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ANGPTL8早期治療對糖尿病幼鼠的短期影響

2.1.1 ANGPTL8對糖尿病模型幼鼠第7天生存率影響

ANGPTL8治療后，糖尿病幼鼠7 d的死亡率如圖1a所示，STZ組死亡率為31%，明顯高于其他三組（均為0）。說明幼鼠出生第1 d給予STZ不僅破壞β細胞，可能會導(dǎo)致肝臟等器官損傷引發(fā)炎癥死亡。圖1b為出生前7 d STZ組和STZ+ANGPTL8組的生存曲線，STZ組自第2 d開始陸續(xù)出現(xiàn)幼鼠死亡，而給予早期治療的STZ+ ANGPTL8組的死亡率為0。

圖1 ANGPTL8治療前7 d各組死亡率和生存曲線圖

穩(wěn)定后糖尿病模型組（STZ組，n=9）、ANGPTL8治療組（STZ+ANGPTL8組，n=11）、對照組（NS組，n=13）、ANGPTL8對照組（NS+ANGPTL8組，n=18），均符合最小樣本量要求。

2.1.2 ANGPTL8對糖尿病幼鼠出生第7天血糖和體重的影響

STZ處理后使幼鼠的血糖水平在前4 d內(nèi)從5 mM升高到22 mM，且明顯高于NS組和NS+ANGPTL8組血糖，從第4 d開始，血糖水平又有所下降，但始終高于NS處理的幼鼠，如圖2所示。血糖升高為STZ破壞β細胞導(dǎo)致胰島素分泌嚴(yán)重不足所致，血糖的回落可能與幼鼠本身胰腺細胞出生后增殖有關(guān)。幼鼠出生后第7 d NS組和NS+ANGPTL8組血糖水平均無明顯差異（P>0.05）。STZ + ANGPTL8組血糖與STZ組比較，降低較快且明顯（P＜0.05）。

圖2 幼鼠出生7 d內(nèi)血糖隨機數(shù)值

如圖3所示，在前7 d的體重變化中，四組體重都呈現(xiàn)上升趨勢，NS組和NS+ANGPTL8組體重上升趨勢一致，而STZ組和STZ+ANGPTL8組體重在第7 d出現(xiàn)明顯差異，STZ + ANGPTL8組體重比STZ組明顯升高（P＜0.05），而 STZ組體重水平比NS組和NS + ANGPTL8組均降低明顯（P＜0.05）。從治療第2 d開始到第7 d結(jié)束，STZ + ANGPTL8組體重增加比STZ組明顯增多（P＜0.05）。

圖3 幼鼠出生7 d內(nèi)體重變化

2.1.3 ANGPTL8對胰腺十二指腸同源盒（Pdx-1）蛋白表達的影響

為進一步探究ANGPTL8對幼鼠胰腺發(fā)育的影響，我們檢測了胰腺組織中胰腺發(fā)育和β細胞增殖和分化重要的調(diào)控因子Pdx-1，如圖4所示，經(jīng)過早期ANGPTL8治療，第7 d STZ + ANGPTL8組Pdx-1蛋白水平比STZ組明顯升高，NS組與NS+ANGPTL8組Pdx-1蛋白水平無明顯差別。

圖4 ANGPTL8早期治療對各組胰腺組織Pdx-1蛋白表達的影響

2.1.4 ANGPTL8對胰腺凋亡蛋白組合Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2比率的影響

由于ANGPTL8對幼鼠早期死亡率有較明顯影響，我們繼而檢測了胰腺組織中促凋亡蛋白Bax與抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表達水平。結(jié)果如圖5，NS 組 Bax/Bcl-2比值與NS+ ANGPTL8比較沒有明顯差異（P＞0.05），STZ組Bax/Bcl-2比值比NS組明顯升高，說明STZ組細胞凋亡程度大于NS組，STZ+ ANGPTL8組Bax/Bcl-2比值比STZ 組明顯降低（P＜0.05）。

圖5 ANGPTL8早期治療對各組胰腺組織Bax/Bcl-2蛋白比率的影響

2.2 ANGPTL8早期治療對糖尿病幼鼠成年后糖代謝和胰島功能和形態(tài)的影響

2.2.1 ANGPTL8對糖尿病新生大鼠幼年至成年血糖變化的影響

如圖6所示，ANGPTL8早期治療后NS組，STZ組和STZ + ANGPTL8組從出生第7 d到出生第10 w每周血糖變化。前兩周STZ + ANGPTL8組血糖比STZ組血糖明顯降低（P＜0.05），且STZ組和NS組血糖沒有統(tǒng)計學(xué)差異。第3 w和第4 w STZ組血糖比NS組血糖顯著升高，從第5 w開始到第8 w，三組血糖都沒有明顯差異。第9 w STZ組血糖高于STZ + ANGPTL8 組（P＜0.05），第10 w STZ組血糖高于NS組（P＜0.05），STZ+ ANGPTL8 組血糖低于STZ組（P＜0.05）。

圖6 早期ANGPTL8治療后各組每w血糖變化

2.2.2 ANGPTL8早期治療對糖尿病幼鼠成年后體重、血糖、胰島素水平的影響

各組成年鼠（第10w）體重、血糖、胰島素結(jié)果如表1所示。STZ組大鼠體重比NS組明顯下降（P＜0.05）。而經(jīng)ANGPTL8早期處理的SZT+ANGPTL8組體重比STZ組明顯升高（P＜0.05），且體重與NS組(n=5)無明顯差異。STZ組大鼠血糖比NS組明顯上升（P＜0.05）。而SZT+ANGPTL8組血糖比STZ組明顯降低（P＜0.05），且胰島素水平比STZ組升高（P＜0.05）。

表1 ANGPTL8治療第70 d各組體重，血糖和胰島素水平比較（±SD）

表1 ANGPTL8治療第70 d各組體重，血糖和胰島素水平比較（±SD）

注：與STZ組相比，*P＜0.05；與NS組相比，#P＜0.05。

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2.2.3 ANGPTL8對糖尿病新生大鼠成年后葡萄糖耐量的影響

在各組大鼠出生后第10w進行腹腔注射葡萄糖耐量實驗（IPGTT），結(jié)果如圖7所示，各組大鼠血糖在30 min到達最大值，之后血糖逐步降低，呈降低趨勢。

圖7 10 w IPGTT血漿葡萄糖水平變化結(jié)果

在各時間段內(nèi)，STZ組血糖顯著高于NS組（P＜0.05），經(jīng)ANGPTL8早 期 治 療 后STZ+ANGPTL8組血糖比STZ組明顯下降（P＜0.05），且與NS組無顯著差異。比較各組曲線下面積如圖8所示，STZ組1-120 min曲線下面積（AUC）比NS組明顯增大（P＜0.05），STZ+ANGPTL8組AUC比STZ組明顯減少（P＜0.05），且與NS組無明顯差異。

圖8 10 w IPGTT血糖曲線下面積

2.2.4 ANGPTL8早期治療的糖尿病新生大鼠成年后胰島形態(tài)和面積變化

為進一步觀察成年后各組胰島形態(tài)和結(jié)構(gòu)的變化，對成年后的各組胰腺組織進行胰島素免疫組織化學(xué)染色，觀察胰島形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性以及比較各組胰島β細胞相對面積。圖9所示為早期STZ 和ANGPTL8處理過的糖尿病大鼠成年后（第10 w）胰島形態(tài)，NS組胰島大而完整，STZ組胰島形態(tài)有缺損且面積明顯變小，經(jīng)治療后STZ + ANGPTL8 組胰島比STZ組略大，和NS組相較仍然有差距。STZ組胰島β細胞相對面積比NS組減小40%（P＜0.05），STZ+ ANGPTL8組β細胞相對面積比STZ 組明顯增大（P＜0.05）詳見圖9。

圖9 .早期ANGPTL8治療對成年鼠各組胰島形態(tài)和胰島β細胞相對面積影響（比例尺300 μm）

3 討論

T1DM是由于胰島β細胞功能障礙導(dǎo)致胰島素分泌絕對缺乏，表現(xiàn)為不依賴胰島素升高的高血糖癥狀。T1DM占所有DM病例的10 - 15%[9]。這種慢性不斷進化的自身免疫性疾病是遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，這些因素觸發(fā)自身免疫性反應(yīng)，通過淋巴細胞，T細胞和自身抗體介導(dǎo)選擇性地破壞胰島β細胞，導(dǎo)致胰島素絕對缺乏[10]。當(dāng)胰島β細胞破壞超過70%時，1型糖尿病高血糖癥狀就會出現(xiàn)[11]。有研究證明ANGPTL8在孕婦和胎兒以及新生兒中的水平變化提示ANGPTL8可能在新生兒代謝疾病及血糖控制中起重要作用[12]。有研究表明ANGPTL8可以改善高血糖癥[12,13]，本實驗中ANGPTL8治療對早期STZ誘導(dǎo)的糖尿病幼鼠模型體重增加也促進作用。但在STZ組糖尿病幼鼠模型中我們觀察到的高血糖只是短暫的，隨后會進行自發(fā)代償性恢復(fù)[14]。即使隨年齡的增長，成年后代償性增殖的能力也會下降，但對于早期胰島損傷過的幼鼠，成年后患有糖尿病的幾率仍大大升高。因此我們猜想ANGPTL8早期治療能否保護β細胞，從而降低成年后糖尿病的發(fā)生率。

已有研究報道，ANGPTL8在長期患有1型糖尿病的病人血清中會有所升高，提示ANGPTL8可能參與β細胞損傷后的代償性修復(fù)作用[15]。Pdx-1是胰腺發(fā)育和細胞分化的必要轉(zhuǎn)錄因子，Pdx-1表達減少會導(dǎo)致細胞凋亡增加[16]。Bcl-2是重要的抗凋亡蛋白，而Bax是促凋亡蛋白[17]。因此我們在前期實驗中通過對胰腺十二指腸同源盒（Pdx-1）蛋白和胰腺凋亡蛋白組合（Bax）和抗凋亡因子（Bcl-2）進行western blot分析，實驗結(jié)果顯示，Pdx-1的胰腺表達上調(diào)和Bax/ Bcl-2比率降低，說明ANGPTL8可能通過增加胰腺組織Pdx-1蛋白的表達來促進胰腺發(fā)育及β細胞增殖，并且通過促進Bcl-2表達、抑制Bax表達來增強抗凋亡機制的激活并促進胰腺干細胞向β細胞的分化，從而擴大β細胞的質(zhì)量，促進β細胞增殖。Zhang Y報道了ANGPTL8通過NF-kB途徑調(diào)節(jié)炎癥[18-20]。STZ組Bax/Bcl-2的比率增加表明早期可能存在炎癥，并最終導(dǎo)致β細胞凋亡。ANGPTL8可以通過減輕炎癥，并最終改善β細胞的凋亡率。

研究者們認(rèn)為STZ組中新近再生的胰島能夠釋放胰島素，但是由于β細胞的胰島素反應(yīng)性可能已經(jīng)受損，因此糖尿病幼鼠成年后血糖水平會出現(xiàn)明顯改變。我們的實驗也驗證了這一點，在第十周腹腔注射葡萄糖耐量實驗（IPGTT）中我們觀察的結(jié)果說明幼年初期給予ANGPTL8干預(yù)可以使葡萄糖耐量恢復(fù)。通過成年大鼠胰腺組織胰島素免疫組化實驗結(jié)果進一步說明在胰島素表達在成年后也能恢復(fù)到正常水平，這與我們成年鼠的血糖結(jié)果是一致的。結(jié)合對新生幼鼠的實驗我們推測ANGPTL8可以保護β細胞抵抗細胞凋亡，促進糖耐量恢復(fù)和胰島細胞生長，阻止成年大鼠糖尿病的發(fā)展。

有研究表明ANGPTL8與T2DM和胰島素抵抗密切相關(guān)[21]，并且可以降低FFA水平和抑制攝食[22]，說明其對脂代謝紊亂控制作用明顯。并且在臍帶血和胎盤中檢測到了ANGPTL8水平，證明ANGPTL8與新生兒發(fā)育和代謝有關(guān)。在這項研究中，我們的結(jié)果進一步證明了對STZ誘導(dǎo)的新生幼鼠模型給予早期重組ANGPTL8治療具有抵抗β細胞凋亡的作用，進而恢復(fù)糖耐量和胰島功能，并表現(xiàn)出抵抗成年糖尿病發(fā)展的潛在作用。本實驗將為ANGPTL8治療和延緩2型糖尿病提供新的治療靶點和策略。

綜上所述，血管生成素樣蛋白8（ANGPTL8）對糖尿病幼鼠成年后血糖的穩(wěn)定和胰島功能的恢復(fù)都有明顯的改善作用。其機制可能與ANGPTL8可以保護β細胞抵抗細胞凋亡有關(guān)。