市售乳酸菌制品中乳酸菌耐藥基因分析

梁媛媛，黃甜甜，夏琪琪，楊云斌，劉鵬鵬*

1.浙江方圓檢測集團股份有限公司（杭州 310018）；2.浙江省市場監管生物安全重點實驗室（杭州 310018）；3.長興縣食品藥品檢驗檢測中心（湖州 313100）

乳酸菌是一類發酵糖類產物為乳酸的革蘭陽性菌，與維護腸道微生物平衡、提高機體免疫力、維持宿主健康密切相關[1]。美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，FDA）將其評價為“普遍安全（generally regarded as safe，GRAS）”的一類。乳酸菌長期以來作為安全的無致病性的益生菌種被廣泛應用于食品、保健品和藥品，如發酵酸奶、固體飲料、腸道微生態制劑等[2-3]。

近年來，隨著抗生素新品種的大量問世及抗菌藥物的大量使用，細菌耐藥性問題越發嚴重。早期的耐藥性研究主要集中在病原微生物領域[4-5]，近期關于乳酸菌的耐藥性所帶來的安全性問題引起廣泛關注[6-7]。FAO/WHO指出，隨著消費者大量食用乳酸菌制品，存在的一種可能的危害是造成菌種攜帶的耐藥基因的轉移，即乳酸菌的耐藥性會通過食物鏈轉移到人體腸道[8]。在體內形成耐藥基因庫，耐藥基因在致病菌和正常菌株之間無屏障傳遞，容易形成天然的耐藥基因池，導致超級細菌的產生，給疾病治療和生命安全帶來潛在的安全風險，也可能成為制約發酵乳制品行業發展的重大安全隱患[9-12]。因此，是否攜帶耐藥基因可成為乳酸菌的安全性評價的依據之一。

β-內酰胺類抗生素系指化學結構中具有β-內酰胺環的一大類抗生素，其通過共價鍵與青霉素結合蛋白結合，從而抑制細菌細胞壁的合成，是臨床使用最為廣泛的一類抗生素，也是目前研究報道中耐受性較普遍存在的一類抗生素。有報道表明，在生產乳制品用的乳桿菌、嗜熱鏈球菌等菌株中檢測到對相關抗生素的耐藥性[13-16]，β-內酰胺酶基因作為耐藥性基因則鮮有檢出。鑒于此，試驗對市售乳酸菌制品中添加的活菌數量和菌種進行分析鑒定，同時考察β-內酰胺酶基因blaZ在這些菌株中的分布和多重耐藥基因的情況，從而為市售乳酸菌制品的安全性評價提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

隨機選取國內市售發酵乳、乳酸菌飲品等77批乳酸菌制品，用瓊脂平板稀釋法對樣品中的乳酸菌進行分離培養。

嗜熱鏈球菌、乳桿菌、雙歧桿菌（均采用MRS瓊脂，北京陸橋生物技術有限責任公司）；莫匹羅星、半胱氨酸鹽酸鹽（均為青島海博生物技術有限公司）；DL500 DNA Marker、10×TBE緩沖溶液（Tris-EDTA）、1 000×D-HelixRed核酸染料和雙蒸餾水（ddH2O）[均為寶日醫生物技術（北京）有限公司]；細菌基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]；2×PCR Taq Mix預混液（北京美萊博醫學科技有限公司）；瓊脂糖（Agarose Regular）、PCR引物、DNA測序、2×高保真PCR Mix預混液和陽性質粒[均為生工生物工程（上海）有限公司]。

1.1.2 儀器與設備

Anoxomat MARK Ⅱ智能厭氧培養系統（美國Gene Science公司）；Beckman Microfuge 16臺式微量離心機（美國貝克曼庫爾特有限公司）；Nano-300超微量分光光度計（杭州奧盛儀器有限公司）；D1200板式加熱器（美國Labnet’s公司）；ABI Veriti梯度PCR儀（美國應用生物系統公司）；Powerpac HC 1645052伯樂高流核酸電泳儀、Gel-Doc-XR+凝膠成像系統（均為美國Bio-Rad公司）；VITEK MS全自動快速微生物質譜檢測系統（法國生物梅里埃公司）。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的分離和培養

乳酸菌制品中的乳酸菌菌株培養按照GB 4789.34—2016《食品微生物學檢驗雙歧桿菌檢驗》和GB 4789.35—2016《食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》進行。

1.2.2 乳酸菌的鑒定

乳酸菌的快速鑒定采用激光解析電離飛行質譜VITEK MS進行。用接種環挑取單個菌落，點在樣品靶板孔中，涂抹均勻并在室溫自然晾干。吸取1 μL基質CHCA溶液與樣品混合，自然晾干，形成結晶，上機測定。

1.2.3 引物設計

參考NCBI數據庫blaZ基因（基因庫序列號MT906815.1），使用Primer Premier 5.0軟件設計上游引物blaZ-F和下游引物blaZ-R；實驗室自行合成鏈霉素耐藥基因strA、strB，四環素耐藥基因tetM、tetK，卡那霉素耐藥基因aph3-Ⅲa和萬古霉素耐藥基因vanX，引物序列如表1所示。

表1 PCR擴增耐藥基因所用引物及擴增產物長度

1.2.4 樣品DNA提取

將培養的單菌落進行擴大培養。用接種環5 μL接種環收集一環菌落，DNA提取方法參考天根細菌基因組DNA提取試劑盒。

1.2.5 PCR反應體系和程序

反應體系：2×PCR反應預混液12.5 μL，正向引物和反向引物各1 μL，挑取單菌落作為DNA模板或者取DNA（10～50 ng/μL）1 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，進行40個循環；72 ℃延伸2 min，反應結束4 ℃保存。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌樣品活菌計數

共采集包括發酵乳、固體飲料等在內的市售乳制品樣品77批。每批樣品按照國標方法進行乳酸菌的培養及活菌計數，計數結果如圖1所示。77批樣品中76批樣品添加活菌數均符合標準要求或者超過標識菌數。據Morovic等[21]報道，67.3%的市售益生菌制品（n=50）在保質期內經活菌計數發現，添加的益生菌活菌數均符合或超過商品標識菌種數，其余樣品的活菌計數值均低于標識。在國內，王綺等[22]利用傅里葉變換近紅外分析儀與紫外-可見分光光度計結合快速測定市售145個乳酸菌樣品，活菌數均超過國家標準（106CFU/mL），與試驗數據較為接近。

圖1 乳酸菌制品活菌數與標識菌數的比較

2.2 耐藥基因分析

通過隨機挑選涵蓋77個樣品的640個菌落進行PCR初步鑒定，得到一批攜帶耐藥基因blaZ的可疑陽性菌。擴大培養后，提取可疑陽性菌菌株的基因組gDNA，利用高保真Taq酶再次進行耐藥基因的PCR鑒定，篩選出攜帶blaZ的菌株47株。結果如表2所示，47株乳酸菌均攜帶耐藥基因blaZ，檢出率為7.34%。其中，24株菌（51.06%）經鑒定只攜帶blaZ，18株菌（38.29%）含有雙重耐藥基因blaZ和tetM，2株菌含有雙重耐藥基因blaZ和aph3-Ⅲa，3株（6.38%）攜帶含有三重耐藥基因blaZ、tetM和aph3-Ⅲa。另外，試驗用同樣方法進行表1中其他耐藥基因的鑒定，結果發現鏈霉素抗性基因（strA和strB）、四環素抗性基因（tetK）及萬古霉素抗性基因（vanX）在試驗中均未檢出。

表2 乳酸菌菌種及其攜帶的耐藥基因

接表2

2.3 菌株鑒定

對攜帶blaZ耐藥基因的47個菌株采用MALDI-TOF MS進行菌種鑒定，結果表明blaZ陽性菌株均為樣品中標識添加的乳酸菌（圖2）。攜帶耐藥基因blaZ的陽性菌主要集中在嗜熱鏈球菌（63.83%），其次是副干酪乳桿菌（17.02%）和動物雙歧桿菌（14.89%），鼠李糖乳桿菌則攜帶blaZ基因的情況較少（4.26%）。對blaZ陽性菌株是否攜帶其他抗生素耐藥基因也進行鑒定和分析。通過各耐藥基因相對豐度的比較結果（表2、圖3）可以看出，所有類型的乳酸菌中，數量僅次于blaZ基因的是氨基糖苷類耐藥基因aph3-Ⅲa，攜帶最少的是四環素類耐藥基因tetM。含有三重耐藥基因的3株菌分別是嗜熱鏈球菌、鼠李糖乳桿菌和動物雙歧桿菌（表2）。

圖2 飛行質譜鑒定菌種組成

圖3 耐藥基因組成的相對豐度分析

3 結論

試驗對隨機選取的市售乳酸菌制品樣品（n=77）進行乳酸菌活菌計數，結果顯示共計76份樣品添加活菌數超過標準要求或者商品標識菌種數，合格率為98.70%。這表明我國對乳酸菌市場加強行業監管已初見成效，但仍存在個別乳酸菌制品的活菌數添加不符合要求的現象。試驗以市售乳酸菌制品為研究對象，調查發現耐藥基因blaZ在樣品中的檢出率為28.57%。氨基糖苷類耐藥基因aph3-Ⅲa在研究中也有檢出，47株blaZ陽性乳酸菌菌株中檢出率為44.68%。四環素耐藥基因tetM和tetK的鑒定中，前者在此次調查中有檢出（10.64%），即5株blaZ陽性乳酸菌菌株中有檢出tetM，而后者在試驗中未檢出。

通過對市售乳酸菌制品中的乳酸菌活菌添加情況的調查及耐藥基因的鑒定和分析顯示，市售乳酸菌制品添加活菌數基本符合標準或者標識要求。同時，乳酸菌菌種具有攜帶一種甚至多種耐藥基因的情況，可能成為耐藥基因的貯存庫，今后需要持續加強食用菌株安全性評價。試驗受傳統PCR方法的局限，檢測的靈敏度和準確度均有待提高。另外據以往報道，耐藥基因和耐藥表型的關聯度較低。因此，對乳酸菌制品中的菌株耐藥表型及其耐藥機理展開調查將成為今后工作的主要方向。