高效液相色譜法測不同大洲咖啡豆綠原酸和咖啡酸的含量

周湧智，毛瑋琪，袁棟勇，畢建辛，張黔文，紀曉娜,2*

1.長春工程學院理學院（長春 130012）；2.吉林省城市污水處理重點實驗室（長春 130012）

咖啡樹是屬茜草科多年生灌木或小喬木，而咖啡豆就是指咖啡樹果實里面的果仁。優等咖啡豆主要產自緯度在0°至南北15°，平均海拔為1 500～3 000 m地區，咖啡是世界上最受歡迎的飲料，它有自己的特點味道和香味。咖啡中的典型化合物，如咖啡因、葫蘆巴堿和綠原酸，已知會影響咖啡風味，增加了酸度，賦予了澀味苦澀。評價咖啡商品質量的化學成分及其含量、精確和準確的分析手段是用于測定這些化學物質多項調查結果為確定咖啡中的成分，包括咖啡酸、綠原酸，都是由高效液相色譜法進行分析。綠原酸具有多種生物學特性，包括抗氧化性抗細菌、抗氧化和抗癌活性特別是低血糖和降血脂的影響。咖啡酸也具有抗菌、抗病毒、中樞興奮等生物活性[1]，通常飲用的咖啡是用咖啡豆配合各種不同的烹煮器具制作出來的。咖啡酸和綠原酸是影響各種風味咖啡的兩大重要有機物質。綠原酸的含量檢測是咖啡豆提取物產品質量控制的關鍵。楊清山等[6]研究了咖啡豆中綠原酸和咖啡因的測定方法，Azuma等[7]研究表明綠原酸不像咖啡酸能很好地從消化道吸收，而且對容易被吸收的形式幾乎沒有任何結構變化。蔡榮華等[12]研究了咖啡豆中綠原酸和咖啡因的測定方法，楊剴舟等[15]研究了響應面優化水-乙醇法提取咖啡豆中有機酸。段麗娜等[16]研究了測定咖啡中七種有機酸的方法。Atlabachew Minaleshewa等[17]提出了鹽析輔助液液萃取法（SALLE）用于咖啡生物堿和綠原酸的提取。而目前還沒有文獻對于同緯度同海拔的咖啡豆進行橫向比較，研究通過探索提取液中甲醇與水的配比、色譜條件等過程，進一步優化了咖啡豆提取的方法，該方法方便快捷、簡單有效，可用于咖啡行業綠色咖啡樣品的質量控制和產地溯源的研究，對檢測咖啡質量提供了參考。

1 試驗部分

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈（色譜純，山東禹王實業有限公司化工分公司）；乙酸（色譜純，佛山西隴化工有限公司）；咖啡酸（色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司）；綠原酸（色譜純，上海源葉生物科技有限公司）；大洋洲巴布亞新幾內亞拉瑪莉咖啡豆（長沙萬物食品貿易有限公司）；非洲埃塞俄比亞西達摩沃爾卡咖啡豆（長沙萬物食品貿易有限公司）；印度尼西亞蘇門答臘曼特寧迷塔咖啡豆（長沙萬物食品貿易有限公司）；危地馬拉奧聯特SHB咖啡豆（長沙萬物食品貿易有限公司）；埃塞俄比亞耶加雪菲咖啡豆（長沙萬物食品貿易有限公司）；超純水，實驗室自制。

1.2 儀器與設備

1260 HPLC型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Poroshell 120 EC-C18型高效液相色譜柱（美國安捷倫公司）；咖啡豆研磨器（90 mm×210 mm帶軸承款，北京惠誠聯合貿易有限公司）；針式濾膜（上海安譜實驗科技股份有限公司）。

1.3 色譜條件分析

根據文獻[4]及條件試驗2.1.2小節，確定DAD檢測波長：285 nm；柱溫為35.0 ℃；流速：1 mL/min；進樣量10 μL；流動相A：0.5%乙酸水溶液，B：乙腈，梯度洗脫V（A）：V（B）=95∶5（0～20 min），85∶15（20～25 min）。

1.4 樣品前處理方法

用手搖磨豆機將咖啡豆打碎，根據文獻[5]所述咖啡豆粉碎至0.425 mm通過率80%以上細度，每次磨碎后多次清洗磨豆機，保證下一次無雜質出現，將篩上物和篩下物混合均勻后，作為待測樣。參考文獻[5]和GB/T 22250—2008[9]《保健食品中綠原酸含量測定》中方法進行超聲提取，即分別取五個不同產地的咖啡豆，準確稱取0.500 g待測樣，置于25 mL容量瓶中，加入20 mL 70%甲醇溶液，室溫超聲提取1.5 h，等待冷卻后，取0.100 mL溶液于2 mL樣品瓶中，加入0.900 mL 70%甲醇后，過0.45 μm濾膜，進樣檢測。

1.5 定性和定量分析

利用保留時間（tR）定性分析，兩種物質標準品的高效液相色譜圖見圖1。

圖1 綠原酸和咖啡酸的混標色譜圖

精密稱取100.0 mg綠原酸標準品，將其全部移入50 mL容量瓶中，并用70%甲醇水定容，得到2 000 mg/L綠原酸標準品母液。采用10 mL容量瓶，用70%甲醇水稀釋至質量濃度分別為5.0，10.0，25.0，50.0，75.0，100.0，200.0和300.0 mg/L的綠原酸標準品溶液，作為梯度標準工作液。

精密稱取20.0 mg咖啡酸標準品，將全部其移入50 mL的容量瓶中，并用70%甲醇水定容，即配得400 mg/L咖啡酸標準品母液。采用10 mL容量瓶，用70%甲醇水稀釋至質量濃度分別為0.2，1.0，2.5，5.0，7.5，15.0，25.0和45.0 mg/L咖啡酸標準梯度溶液，作為梯度標準工作液。將配制好的梯度工作曲線進樣測試并采用外標法分析，結果見表1。

表1 綠原酸和咖啡酸的色譜定性分析數據

1.6 咖啡豆中綠原酸和咖啡酸濃度計算

取一定量的咖啡豆進行萃取前處理，濃縮定容，高效液相色譜檢測，通過式（1）和式（2）確定咖啡酸和綠原酸的濃度。

式中：c咖啡酸和c綠原酸為試樣中咖啡酸和綠原酸的質量濃度，mg/L；A為液相色譜圖對應綠原酸或咖啡酸色譜峰面積，mAU·min；V為萃取、濃縮后試樣體積，mL；V0為水樣體積，mL。

2 結果與討論

2.1 色譜條件優化試驗

2.1.1 提取液的確定

提取不同體積分數的甲醇水溶液對咖啡豆粉的提取效果情況見表2。取5份同種同質的咖啡豆粉，按照1.3小節樣品前處理方法，分別加入等量不同濃度的甲醇水溶液進行提取試驗（40%，50%，60%，70%和80%體積分數的甲醇水溶液）對咖啡豆中綠原酸和咖啡酸的提取效果情況。結果表明，70%甲醇提取出的綠原酸含量均高于其他幾種提取溶劑，因此選擇70%甲醇作為提取溶劑。

表2 咖啡粉提取液的選擇

2.1.2 流動相的選擇

在流動相的選擇上，根據文獻[2-5]，分別用流動相[a.流動相V（0.5%甲酸水溶液）∶V（乙腈）=95∶5；b.流動相V（0.5%乙酸水溶液）∶V（乙腈）=95∶5；c.流動相V（0.5%乙酸水溶液）∶V（乙腈）=85∶15；d.流動相V（1.0%乙酸水溶液）∶V（乙腈）=95∶5]對同種咖啡豆提取液進行試驗。

根據圖譜數據，流動相b的分離度較好，色譜峰清晰且樣品流出時間較短，故選用流動相V（0.5%乙酸水溶液）∶V（乙腈）=95∶5對于檢測綠原酸和咖啡酸較為適宜。

經過以上優化試驗，確定了HPLC-DAD測定咖啡豆中咖啡酸和綠原酸的色譜條件：DAD檢測波長285 nm；柱溫35.0 ℃；流速1 mL/min；進樣量10 μL；流動相V（0.5%乙酸水溶液）∶V（乙腈）=95∶5。

2.2 咖啡豆提取液測試

取咖啡豆水樣按1.3小節方法進行前處理，色譜分析結果見圖2。

圖2 埃塞俄比亞西達摩咖啡豆提取液色譜分析圖

按式（1）和式（2）對綠原酸和咖啡酸分別定量，結果為見表3。

表3 咖啡HPLC定量分析數據

2.3 加標回收率

對咖啡豆提取液進行3水平加標回收試驗（見表4），綠原酸的回收率為82.4%～86.3%，咖啡酸的回收率為86.8%～92.4%，說明前處理檢測方法可靠。

表4 三水平加標回收率

2.4 最低檢出限

將含有1.600 mg/kg的綠原酸和咖啡酸的標準溶液分別多次稀釋后進行液相色譜分析，至信噪比（rSN）在2～5之間，確定最低檢出限，綠原酸為0.320 mg/kg（rSN=2.35），咖啡酸為0.200 mg/kg（rSN=3.58）。

2.5 精密度

取不同大洲咖啡豆的提取溶液重復測定7次，得到綠原酸和咖啡酸的平均濃度、偏差和相對標準偏差，結果見表5。對五種咖啡豆分別進行七次平行試驗，檢測圖譜中未出現咖啡酸，故咖啡酸均未檢出。

表5 咖啡豆樣品中綠原酸的定量結果

3 結論

試驗考察了萃取液使用甲醇和水的比例、流動相的選用和流動相的比例三個色譜條件，確定了HPLCDAD檢測咖啡豆中綠原酸和咖啡酸的含量的最優條件。研究建立了一種咖啡豆中綠原酸及咖啡酸的定量方法，并使用該方法初步分析了不同大洲咖啡豆中咖啡酸和綠原酸含量的變化。結果表明，綠原酸和咖啡酸的線性關系、檢出限、精密度、重復性以及加標回收率等都滿足檢測需求，方法簡便、快速，檢測設備要求低、結果準確。并可初步判斷非洲產出的咖啡豆較其他大洲的綠原酸含量更高，風味更好，方法可以廣泛應用于咖啡豆中綠原酸和咖啡酸的含量檢測，同時也可繼續優化，進一步檢測咖啡豆中更多有機酸的含量。