UPLC-MS/MS測定海帶中酰胺醇類藥物殘留

陳建南

福建中檢華日食品安全檢測有限公司（福州 350028）

酰胺醇類藥物又稱氯霉素類藥物，其主要有氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考，主要治療畜禽及水產動物細菌性疾病，因此被廣泛用于畜禽和水產品養殖行業[1]。其中，氯霉素在使用過程會出現致命的灰嬰綜合征和再生障礙性貧血癥[2-3]，因此被我國及其他一些國家和地區禁止使用。隨著氯霉素的禁用，甲砜霉素和氟苯尼考成為在治療水產動物細菌性疾病的主力軍。海帶不僅營養價值高且具有一定藥用價值，是人們經常食用的植物，但是，它們可以吸收富集在周圍環境的抗生素，因此為防止海帶中的酰胺醇類藥物對人體健康造成危害，建立海帶中氯霉素殘留量的有效檢測方法顯得尤為重要。

酰胺醇類藥物的分析手段主要有氣相色譜法、高效液相色譜法和高效液相色譜-串聯質譜聯用色譜法[4-9]。由于氣相和液相色譜不僅靈敏度不夠、定性能力差且前處理方法較繁瑣，而高效液相色譜-串聯質譜聯用色譜法具有靈敏度較高、無需衍生化、檢測時間短等特點。QuEChERS法[10-11]、固相萃取法[12]、加速溶劑萃取法[13]是酰胺醇類藥物的前處理手段。固相萃取法步驟較繁瑣，加速溶劑萃取法所用到儀器較貴且需要時間較長，而QuEChERS法操作具有簡便、時間短、試劑用量少等特點。目前，關于酰胺醇類藥物在海帶中的殘留分析尚未被報道。

試驗采用QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法，建立海帶中的酰胺醇類藥物殘留分析方法。同時探究該方法中提取劑和凈化劑對檢測結果的影響，以期為海帶中酰胺醇類藥物殘留量的檢測提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

乙腈和甲醇（色譜純，默克公司）；甲酸和乙酸（美國Fisher公司）；試驗用水為超純水；N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基鍵合硅膠（C18）和石墨化碳黑（GCB）：均為天津Agela公司；氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考（德國Dr.Ehrenstorfer公司）。

高效液相色譜-質譜聯用儀、C18色譜柱（美國Agilent公司）；多管渦旋混勻儀（逗點生物技術有限公司）；Direct-Q3超純水機（美國Millipore公司）；TDL-5C-PRP低高速離心機（上海安亭科學儀器廠），N-EVAP-12氮吹儀（美國Organomation公司）；3k15高速離心機（美國Sigma公司）。

1.2 標準溶液的配制

分別準確稱取適量的氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考標準品，甲醇為溶劑，定容于3個50 mL容量瓶中，配制成質量濃度200 μg/mL的母液，各取0.4 mL于50 mL容量瓶中配得1.0 μg/mL的儲備液，采用系列稀釋法分別配制質量濃度為0.50，1.00，2.00，5.00，10.00和20.00 ng/mL標準工作溶液，于-18 ℃避光保存。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18；流速0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL；流動相A，10%甲醇純水；B甲醇，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.3.2 質譜條件

質譜條件：離子源采用ESI源，掃描方式采用負離子模式，毛細管電壓3.0 kV，離子源溫度350 ℃，脫溶劑氣溫度350 ℃，錐孔反吹氣流量50 L/h，脫溶劑氣流量900 L/h，駐留時間為60 ms，多反應監測模式（MRM）。

表2 質譜參數

1.4 樣品前處理

準確稱10.0 g（精確至0.01 g）樣品于50 mL離心管中，添加氯霉素內標、10 mL乙腈和2 g 氯化鈉，加入1顆陶瓷均質子，加蓋振搖，在3 500 r/min條件下的離心機內離心5 min，取3.0 mL上清液轉移至5.0 mL的離心管（300 mg無水硫酸鎂、100 mg C18、100 mg PSA和50 mg GCB）中，高速離心后，取1.0 mL于40 ℃溫度下氮吹至干，加入1.0 mL甲醇水（3+7，V/V）復溶，過0.22 μm有機濾膜，上機檢測。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的選擇

為保證試驗結果的準確性，對分析物的母離子、子離子、碰撞能等質譜參數進行優化。采用Q1 Scan方式獲取待測物的母離子，在SIM模式下對母離子的去簇電壓進行優化。進行Product Ion掃描，得到2個響應較大的子離子，對子離子進行碰撞能量優化，從而優化質譜條件，采用MRM模式對待測物的駐留時間進行優化，使每個化合物的采集點約在15個點左右。在上述優化的LC-MS/MS條件下，質量濃度為1.0 μg/L的氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考，TIC圖譜如圖1所示。

圖1 標準溶液中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的總離子流色譜圖

2.2 提取劑的優化

乙腈、甲醇和乙酸乙酯是酰胺醇類藥物常用的提取劑，添加2 μg/kg的混標對3種溶劑的提取效率進行考察。試驗結果表明，水與甲醇無法分開，提取溶液顏色較深；乙酸乙酯可與水分離，但是提取色素較多不利于后續的凈化；乙腈為提取劑時，回收率在80.5%～102%之間，加入氯化鈉后可與水分層且提取的色素較少，故選乙腈作為提取劑。

2.3 凈化劑的選擇

PSA、C18和GCB為常用凈化劑，PAS可有效去除掉基質中的有機酸、金屬離子和部分糖等物質，C18去除非極性化合物，GCB可去除一些非極性色素。探究PSA、GCB和C18用量對酰胺醇類藥物回收率的影響。結果發現，PSA和C18為100 mg時，回收率為80.9%～110%，但是上機液的顏色較深；GCB為50 mg時，3種化合物的回收率在90.7%～103%之間，且樣品比較澄清。因此采用100 mg PSA、100 mg C18，50 mg GCB作為混合凈化劑。

2.4 基質效應

物質在檢測的時不可避免受到基質效應影響[14]。對于液質來說，主要是因為雜質與目標物在離子化的過程中發生競爭[15]。為確保試驗結果的準確性，對基質效應進行研究。以測定空白海帶提取液與溶劑相同的濃度的響應比值作為評價基質效應（ME），當ME越偏離1.0時，基質效應越大，越接近1.0時，基質效應越小[16]。結果表明，氯霉素、甲砜霉素與氟苯尼考的比值分別為0.92，0.94和1.05，這3個化合物受基質效應較小。

2.5 標準曲線、檢出限和定量限

用甲醇水（3+7，V/V）稀釋儲備液配制成質量濃度分別為0.50，1.00，2.00，5.00，10.00和20.00 ng/mL的混合標準溶液作標準曲線，以濃度為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y），繪制校準曲線。結果如表3所示，氯霉素、甲砜霉素與氟苯尼考在0.50～20 ng/mL范圍內線性良好，相關系數r＞0.999，在空白樣品中添加，以信噪比（rSN）=3檢出限（rLOD），以最小的添加濃度為定量限（rLOQ），氯霉素、甲砜霉素與氟苯尼考的rLOD分別為0.54，0.12和0.07 μg/kg，rLOQ為1.0 μg/kg。

表3 氯霉素、甲砜霉素與氟苯尼考的線性方程、相關系數、檢出限和定量限

2.6 準確度和精密度

分別選取不同基質樣品，進行1.0，5.0和10.0 μg/kg的三水平加標試驗，結果見表4。氯霉素、甲砜霉素與氟苯尼考在不同基質的3水平加標回收試驗中：氯霉素回收率為87.8%～103.4%，SRSD為2.6%～6.7%；甲砜霉素回收率為89.1%～109.5%，SRSD為3.4%～9.5%；氟苯尼考回收率為89.5%～108.3%，SRSD為2.1%～7.3%。結果表明，該方法具有較高的準確度和精密度。

表4 氯霉素、甲砜霉素與氟苯尼考的回收率和精密度（n=6）

2.7 實際樣品檢測

從市場上購買20批次海帶，并按該試驗方法進行檢測。結果顯示，某一批次海帶中檢測出氯霉素，質量分數為2.0 μg/kg，其余批次均無檢出。

3 結論

試驗建立QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法測定海帶中酰胺醇類藥物的方法，該方法基質效應較弱，準確度和精密度較高，方法簡便和高效，有望為海帶中酰胺醇類藥物的檢測提供技術支持。