液質聯用法測定食品中罌粟堿的不確定度評定

陳夢，張維波，王偉影，范蕾，章小洪，何志豪

麗水市質量檢驗檢測研究院（麗水 323000）

罌粟殼是罌粟科植物罌粟干燥成熟后的果實[1]，含有20多種生物堿[2]，屬于國家管制藥品，部分不良商家為牟取暴利會在食品中添加罌粟殼[3-5]，長期食用添加罌粟殼的食物容易上癮，嚴重時還會引起精神失常，窒息死亡等[6-7]。早在2016年罌粟殼就已被中華人民共和國國家衛生健康委員會列入《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑品種名單（第一批）》[8-9]，但是目前食品中罌粟殼生物堿的檢測方法尚無國家標準[10]，給食品監管工作帶來了一定的困難，現采用的法定檢測方法為2018年市場監管總局發布的《食品中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因的測定》[11]。目前尚未發現采用同位素內標法測定5種生物堿的不確定度評定報道。準確測定生物堿含量，對保障食品安全具有重要意義。此次試驗依據BJS 201802《食品中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因的測定》、CNAS-GL006-2019《化學分析中不確定度的評估指南》[12]、JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[13]和JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規程》[14]等標準，對同位素內標-超高效液相色譜-質譜法測定食品中5種生物堿的不確定度進行分析與評定，旨在提高檢驗結果的準確性，為與之相關的司法裁決、行政處罰等提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

TQ Detector高效液相色譜-質譜儀（配ESI源，美國Waters公司）；Direct Pro超純水機（德國Think-lab公司）；KQ-250DE超聲清洗器（昆山超聲儀器公司）；ST16高速離心機（美國Thermo Fisher公司）；Micro17高速離心機（美國Thermo Fisher公司）；MS3 basic渦旋（德國IKA公司）。

嗎啡（含量：50.0 mg/L；不確定度：2.5 mg/L）、可待因（含量：50.0 mg/L；不確定度：2.5 mg/L）、罌粟堿（含量：10.0 mg/L；不確定度：0.5 mg/L）、那可丁（含量：10.0 mg/L；不確定度：0.5 mg/L）、蒂巴因（含量：10.0 mg/L；不確定度：0.5 mg/L）、嗎啡-D3（含量：20.0 mg/L；不確定度：1.0 mg/L）、可待因-D3（含量：20.0 mg/L；不確定度：1.0 mg/L），混合標準品溶液購于上海安譜公司；甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck公司）；鹽酸（優級純，四川西隴公司）；甲酸（色譜純，上海安譜公司）；甲酸銨（色譜純，美國Fisher Scientific公司）；6 g無水硫酸鎂和1.5 g無水醋酸鈉混合粉末（分析純，上海安譜公司）；有機相濾膜（0.22 μm，天津津騰公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理

準確稱取試樣2 g（精確至0.01 g）于離心管中，加入60 μL同位素內標工作液（5.0 μg/mL），加入5 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液，渦旋振蕩30 s，準確移入15 mL乙腈，渦旋振蕩1 min，超聲提取30 min，取出加入6 g無水硫酸鎂和1.5 g無水醋酸鈉，渦旋振蕩2 min，按5 000 r/min離心5 min，取部分上清液過有機相濾膜，供液相-質譜儀進行測定。

1.2.2 標準溶液的配制

準確移取1.0 mL生物堿混合標準溶液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，搖勻，作為混合標準品溶液。準確移取1.25 mL可待因-D3、嗎啡-D3內標溶液于5 mL容量瓶中，用乙腈定容，搖勻，作為混合內標溶液。分別準確吸取20，40，100，200，400和1 000 μL混合標準品溶液于20 mL容量瓶中，再分別準確加入80 μL混合內標溶液，用乙腈定容至刻度，搖勻，作為標準工作溶液。罌粟堿、那可丁、蒂巴因的質量濃度為1，2，5，10和50 ng/mL，嗎啡、可待因的質量濃度為5，10，25，50和250 ng/mL，可待因-D3、嗎啡-D3的質量濃度為20 ng/mL。

1.2.3 儀器條件

1) 色譜條件

色譜柱：HILIC色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；進樣量：5 μL；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL/min；流動相梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2) 質譜條件

離子源：ESI源；掃描方式：負離子；載氣：高純氮氣；碰撞氣：高純氬氣；毛細管電壓：3.0 kV；脫溶劑氣溫度500 ℃；離子源溫度：150 ℃；檢測方式：多反應監測；其他參數見表2。

表2 質譜參數

1.2.4 不確定度數學模型建立

食品中5種生物堿含量按式（1）計算。

式中：X為供試品中待測組分的含量，μg/kg；A為罌粟堿、那可丁、蒂巴因為待測組分的峰面積，嗎啡、可待因為待測組分與內標物組分峰面積的比值；Cs為對照品溶液中待測組分的質量濃度，ng/mL；V為樣品溶液的稀釋倍數，mL；m為樣品質量，g；R為待測組分的回收率；As為罌粟堿、蒂巴因、那可丁為待測組分的峰面積，嗎啡、可待因為待測組分與內標物組分峰面積的比值。

2 不確定度來源分析及評定

2.1 不確定度來源分析

依據標準方法及數學模型，5種生物堿含量不確定度分量主要來源為：Urel(1)樣品稱量引入；Urel(2)樣品定容引入；Urel(3)標準物質引入；Urel(4)內標物質引入；Urel(5)回收率引入；Urel(6)測量重復性引入，合成為

2.2 不確定度分量的評定

2.2.1 樣品稱量引入的不確定度

2.2.2 樣品定容引入的不確定度

樣品定容過程不確定度主要來源于玻璃量器體積校準和環境溫度變化，單標線15 mL移液管允許誤差為±0.025 mL，按矩形分布，不確定度為：溫度變化20±2 ℃，乙腈的膨脹系數為1.37×10-3，不確定度為：U(2.2)=15×2×樣品定容引入的相對標準不確定度為：

2.2.3 標準物質、內標物質引入的不確定度

1) 標準物質純度引入的不確定度：嗎啡、可待因擴展不確定度2.5 mg/L（k=2），罌粟堿、那可丁、蒂巴因擴展不確定度0.5 mg/L（k=2），標準物質純度引入的相對標準不確定度為：U(3.1)=u/(p×2)，見表3。

表3 標準物質純度的相對標準不確定度

2) 內標物質純度引入的不確定度：嗎啡-D3、可待因-D3擴展不確定度1.0 mg/L（k=2），標準物質純度引入的相對標準不確定度為：U(3.2)=1/(20×2)=0.025 0。

3) 標準物質稀釋過程引入的不確定度：A級10 mL容量瓶、單標線1 mL移液管允許誤差分別為±0.020 mL、±0.007 mL，按矩形分布，不確定度為：0.004 04 mL，溫度變化20±2 ℃，乙腈的膨脹系數為1.37×10-3，不確定度為：0.015 8 mL和標準品溶液定容產生的相對標準不確定度為：U(3.7)=4.76×10-3。

4) 內標物質稀釋過程引入的不確定度：A級5 mL容量瓶、2 mL刻度液管，允許誤差分別為±0.020 mL和±0.012 mL，按矩形分布，不確定度為：mL，溫度變化20±2 ℃，乙腈的膨脹系數為1.37×10-3，不確定度為：0.007 91 mL和mL，內標定容產生的相對標準不確定度為：U(3.12)=6.41×10-3。

5) 標準工作曲線配制引入的不確定度：分別移取20，40，100，200，400和1 000 μL混合標準溶液于20 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得到標準工作曲線溶液。根據移液器檢定規程要求，假設均勻分布，引入的不確定度見表4，合成相對標準不確定度為：

表4 標準工作曲線配制引入的不確定度

6) 標準曲線擬合引入的不確定度：

罌粟堿、那可丁、蒂巴因采用外標法計算，嗎啡和可待因采用內標法計算，標準曲線工作溶液的分別測定1次，外標法以待測組分色譜峰的峰面積為縱坐標，內標法以待測組分與內標物組分峰面積比值為縱坐標，濃度為橫坐標，最小二乘法進行擬合，計算標準曲線的殘差標準差s=校準曲線測定次數；a：校準曲線斜率；b：校準曲線截距；xi：標準曲線濃度；yi：外標法為不同濃度對應的待測組分峰面積，內標法為待測組分與內標物組分峰面積比值），具體見表6。

表5 標準工作曲線相關信息

對上述標準物質不確定度進行合成，得到相對合成標準不確定度Urel(3)，詳見表6。

表6 標準物質的相對標準不確定度

2.2.4 添加內標物質引入的不確定度

1) 樣品添加內標物引入的不確定度：樣品前處理過程中5 μg/mL內標工作液加入體積為60 μL，根據JJG 646—2006《移液器檢定規程》[15]可知，100 μL移液槍允許誤差為3.0%（參考50 μL檢定點），按均勻分布處理，體積引入的不確定度為U(4.1)=0.1×0.03/=1.73×10-3mL。溫度范圍20±2 ℃，乙腈的體積膨脹系數為1.37×10-3，假設按矩形分布，k=溫度引入的不確定度為U(4.2)=0.06×2×1.37×相對不確定度為U(4.3)=

2) 標準工作曲線溶液添加內標物引入的不確定度：內標工作液加入量為80 μL，100 μL移液槍允許誤差為2.0%（參考100 μL檢定點），按均勻分布處理，體積引入的不確定度為U(4.4)=0.1×0.02/=1.15×10-3mL。溫度范圍20±2 ℃，乙腈的體積膨脹系數為1.37×10-3，假設按矩形分布，溫度引入的不確定度為U(4.5)=0.08×2×1.37×相對不確定度為U(4.6)=內 標 物引入的相對不確定度為：0.032 3。

2.2.5 回收率引入的不確定度

空白加標樣品經1.2.1小節處理后得到上清液，嗎啡、可待因的加標水平為93.75 μg/kg，罌粟堿、那可丁和蒂巴因的加標水平為18.75 μg/kg，共平行加標6份，測定回收率，并計算相對標準不確定度：結果見表7。對回收率進行顯著性檢驗分析，當自由度f=4時，查t臨界值分布表，t（0.05, 4）=2.776，t＞t（0.05, 4），回收率具有顯著性，因此，考慮其引入的不確定度。

表7 樣品回收率

2.2.6 測量重復性引入的不確定度

試驗將過程中的隨機影響合并為測量重復性，重復測定6次空白加標樣品，計算重復性引入的相對不確定度：見表8。

表8 樣品數據

2.3 合成標準不確定度評定

Urel=相對不確定度合成見表9。假定置信概率P為95%，取包含因子k=2，含量測定結果表示為罌粟堿16.84±1.94 μg/kg，那可丁15.74±1.50 μg/kg，蒂巴因15.33±1.67 μg/kg，嗎啡78.37±10.6 μg/kg，可待因75.27±10.0 μg/kg。

表9 相對標準不確定度

3 結論

試驗依據BJS 201802《食品中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因的測定》測定食品中5種生物堿的含量，通過對各分量不確定度的分析，其擴展不確定度為罌粟堿X=16.84±1.94 μg/kg，那可丁X=15.74±1.50 μg/kg，蒂巴因X=15.33±1.67 μg/kg，嗎啡X=78.37±10.6 μg/kg，可待因X=75.27±10.0 μg/kg，k=2。該方法的不確定度主要來源于標準品的純度、標準溶液的配制以及標準工作曲線的擬合，在日常檢驗工作中可以通過選擇高純度標準品、優化標準溶液的配制、增加標準溶液的測定次數等方法來提高檢測數據的準確性。