基于LC-MS的不同年份葛根茯苓酵素有機成分的比較

張國棟，李旭東，楊琴，黃武軍，徐向榮

1.江西農業工程職業學院（樟樹 331200）；2.仁和集團發展有限公司（樟樹 331200）；3.江西仁仁健康產業有限公司（樟樹 331200）

食用植物酵素是以可用于食品加工的植物為主要原料，添加或不添加輔料，經微生物發酵制得的含有特定生物活性成分可供人類食用的酵素產品[1]。根據《酵素產品分類導則》，酵素根據原料分為植物酵素、動物酵素、菌類酵素，植物酵素又分為果蔬酵素如蘋果酵素、葡萄酵素等，植物干制品制得的酵素如紅棗酵素、枸杞酵素等，動物酵素如阿膠酵素、魚蛋白酵素，菌類酵素如銀耳酵素、蛹蟲草酵素等[2]。

葛根茯苓酵素是以葛根、茯苓、羅漢果、龍眼肉、紅棗、枸杞子、甘草等藥食同源中藥材為原料，通過水提后經乳酸菌、酵母和醋酸菌等可食用菌種復合發酵而成的一款植物飲料，經人群長期食用和相關文獻證明，具有解酒護肝、解油膩、潤腸通便的作用[3]。

葛根茯苓酵素在生產過程中會依照酒、醋等發酵產品一樣，發酵完畢后進行一定時間的陳放再灌裝進行銷售[4]，陳放后的酵素氣味更加濃郁，口感更加柔和，但陳放對酵素的化學成分影響如何，尚未見相關研究報道。

葛根茯苓酵素為中藥材復方，其成分復雜，經微生物轉化后復雜程度更高，采用傳統的分離、提取、純化后再鑒定的方法來分析其成分耗時耗力，且難以發現其中痕量成分。近年來，色譜質譜聯用技術的發展，LC-MS技術已成為鑒定未知化合物的有效手段[5]。高分辨質譜可以提供化合物的準確分子量，根據化合物的多級質譜信息、保留時間結合相應的文獻和化合物數據庫，可以快速鑒定出溶液中的成分。試驗使用LC-MS對不同陳放時間的葛根茯苓酵素的化學成分進行比較分析，以期揭示陳放對葛根茯苓酵素化學成分的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛根茯苓酵素（江西仁仁健康產業有限公司）。乙腈（ACN，質譜純，德國Merck公司）；甲酸（FA，色譜純，美國Acros公司）。

1.2 儀器與設備

色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm，Hypersi Gold aQ）；色譜儀（賽默飛，UltiMate 3000 UHPLC）；質譜儀（賽默飛，Q Exactive Focus）。

數據處理軟件：Compound Discoverer，MassFrontier，Trace Finder。

數據庫：中藥成分數據庫，mzCloud，Chem Spider。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件

樣品經0.2 μm濾膜過濾進樣分析，進樣量5 μL，紫外檢測器波長254 nm；色譜柱Hypersi Gold aQ（100 mm×2.1 mm，1.9 μm），進樣室溫度10 ℃，柱溫30 ℃；流動相A為0.1%甲酸乙腈溶液，流動相B為0.1%的甲酸水溶液，洗脫條件：0～42 min，100% B；42～48 min，5% B；48～51 min，100% B。

1.3.2 質譜條件

離子源為HESI源，正負離子檢測模式，鞘氣流速設定40 arb，輔助氣流速10 arb；噴霧電壓3 500/3 200 V；離子傳輸管溫度320 ℃；輔助氣溫度350 ℃；掃描模式Full MS/dd-MS2，Full MS分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500，掃描范圍m/z100～1 500，50～750。MS/MS模式時，碰撞能40 eV。

2 結果與分析

2016年份和2018年份的葛根茯苓酵素的紫外色譜圖見圖1和圖2，正負離子同時采集譜圖分別見圖3和圖4。如圖1和圖2所示，因酵素中成分復雜，各峰之間的分離度相對來說較差。

圖2 2018年份葛根茯苓酵素紫外色譜圖

圖3 2016年份葛根茯苓酵素正負離子同時采集譜圖

圖4 2016年份葛根茯苓酵素正負離子同時采集譜圖

根據LC-MS結果與數據庫比對，2個年份檢出的成分如表1所示。

根據數據庫匹配，2個年份的葛根茯苓酵素共檢出171種物質，推測物質如表1所示。這些物質種類繁多，有黃酮類、氨基酸及其衍生物類、生物堿類、有機酸類、酯類、含氮類、醛酮類、還有脂肪類等，表明該葛根茯苓酵素成分復雜，各種來源于原料的成分和發酵所產生的初級代謝產物眾多。這些物質中，數量最多的為有機酸類，這與酵素為發酵產物，主要代謝產物為有機酸相符，其后依次為黃酮類和氨基酸及其衍生物。

表1 2016和2018年份葛根茯苓酵素檢出的成分及其峰面積

在2016年份和2018年份峰面積占比超過1%的物質有大豆素、DL-4-羥基苯乳酸、2-異丙基蘋果酸、2-羥基己酸、3-苯基乳酸、琥珀酸、3-羥基-3-甲基甘氨酸、5-羥甲基-2-糠醛、2-羥基-2-甲基丁酸、惕格酸、L-蘇氨酸、蘋果酸、DL-乳酸、α-羥基戊二酸、戊烯二酸。由表2可知，2016年份的含量最多的3種主要成分分別為乳酸、琥珀酸和惕格酸，2018年份的為DL-乳酸、琥珀酸和3-苯基乳酸。相比較而言，2018年份中檢出的物質更多，在2016年份中檢出的而2018年份中未檢出的有6種，而在2018年份中檢出而2016年份中未檢出的有19種。對比2個年份酵素的物質總體含量，其主要成分相似，微量成分略有差異。

表2 2016和2018年份酵素中成分種類

接表1

3 結論

酒、醋等在陳釀過程中，其所含成分會發生一定變化，如酒中的醇酸反應生產酯使酒的陳釀香氣更加濃郁，酒中的乙醇分子重排使酒的口感變得更柔和[6]。酵素在陳放過程中風味會發生一定的變化，刺激性氣味減弱，口感變得柔和，但根據質譜分析結果，2個不同年份的葛根茯苓酵素主要成分基本相同，僅在微量成分上具有一定差異。因此該風味上的變化可能是微量成分所致，或者發酵中所發生的并非化學變化，僅為物理變化。

葛根茯苓酵素因其為復方，通過LC-MS檢測發現，該酵素含有非常多的有機物成分，這些有機成分有些是來自于中藥材本身，有些是中藥材成分在經過微生物的轉化后產生，有些是微生物新產生的代謝產物，如各種有機酸、氨基酸等[7]，通過這些成分的共同作用，產生抗氧化、促進消化，改善腸道微生態等功效，對身體有比較高的保健價值。隨著近年來我國酵素產業的發展，以及我國中醫藥行業的深入發掘，中藥材草本酵素具有較大的發展空間，對于草本酵素的研究也會更加深入。