響應(yīng)面法優(yōu)化牛大力堿溶性多糖的提取工藝

陳建旭，劉艷芬，劉美鈿，曾月潔，鄧金影

1.廣東美味源香料股份有限公司（陽江 529800）；2.鶴山市東古調(diào)味食品有限公司（鶴山 529700）

牛大力（Millettia specisoa），俗稱山蓮藕、血藤、九龍串珠、甜牛大力、牛古大力、大力薯等[1]，為豆科美麗崖豆藤屬植物，作為一種藥食同源植物在中國南方被廣泛種植[2]，主要分布于貴州、湖南、福建、廣東、廣西、海南等地[3]，其干燥根可入藥，性味甘、平，具有強(qiáng)筋活絡(luò)、補(bǔ)虛潤肺等功用，藥用歷史悠久，臨床證明其對多種慢性疾病，如腰痛、腰肌勞損、腎虛帶下、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性肝炎、病后體虛等有治療作用[4]。牛大力還具有抗氧化和清除自由基、提高免疫、抗疲勞、抗炎、降血糖、平喘、祛痰、鎮(zhèn)咳及保肝作用[5-7]。

目前，已有超過50種包括生物堿、黃酮類、苯丙素類、揮發(fā)油成分、甾醇類等化合物從牛大力中分離出來[2]，尚未見有關(guān)牛大力堿溶性多糖提取的研究報(bào)道。因此文章在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面法優(yōu)化牛大力堿溶性多糖的提取工藝，以期為牛大力資源的開發(fā)和綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛大力，廣東陽西宏偉牛大力產(chǎn)學(xué)研產(chǎn)業(yè)基地，50 ℃烘箱中干燥，粉碎，過0.25 mm篩備用；無水乙醇、氫氧化鈉、苯酚、濃硫酸、鹽酸、葡萄糖均分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

800Y高速多功能粉碎機(jī)（永康市鉑歐五金制品有限公司）；YRE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-D（III）型循環(huán)水式真空泵（上海一凱儀器設(shè)備有限公司）；SHA-B水浴恒溫振蕩器（常州澳華儀器有限公司）；DHG-9140A鼓風(fēng)干燥箱（上海慧泰儀器制造有限公司）；N4S紫外可見分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）；BCE2241-1CCN電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；TDL-4高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.3 測定方法

多糖含量的測定：苯酚-硫酸法[8]；水分測定：105 ℃恒重法（GB 5009.3—2016）[9]。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 牛大力粉的制備

將牛大力置于50 ℃烘箱中干燥，粉碎，過0.85 mm篩，95%乙醇脫脂兩次，超聲水提，置于50℃烘箱中干燥，粉粹，過0.15 mm篩，得牛大力粉并保存。經(jīng)測定此牛大力粉水分含量為11.59%。

1.4.2 牛大力堿溶性多糖的提取

準(zhǔn)確稱取2 g已制備好的牛大力粉，按一定的液料比加入一定質(zhì)量濃度的NaOH溶液，在一定的溫度下提取一定的時(shí)間后進(jìn)行離心，所得濾液置于4 ℃冰箱保存。

1.4.3 牛大力中堿溶性多糖提取率（%）的計(jì)算

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取100 mg 105 ℃干燥恒重的葡萄糖，置100 mL容量瓶中定容。準(zhǔn)確吸取20，40，60，80，100，120和140 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液，分置于比色管中，各加入蒸餾水使體積為2.0 mL，再各加1.0 mL 5%的苯酚，搖勻，迅速滴加5.0 mL濃硫酸，搖勻后于室溫下顯色30 min。另取2 mL蒸餾水，同上操作加苯酚和硫酸進(jìn)行顯色反應(yīng)，作為空白對照。在波長190 nm處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

以葡萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。得回歸方程y=4.955 4x+0.010 9，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5，具有較好相關(guān)性。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 NaOH濃度對牛大力堿溶性多糖提取率的影響

NaOH濃度分別選擇2%，3%，4%，5%，6%和7%來進(jìn)行試驗(yàn)，考察NaOH濃度對牛大力堿溶性多糖提取率的影響，試驗(yàn)條件：溫度50 ℃、時(shí)間2 h、液料比20∶1（mL/g）、提取次數(shù)1次，試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 NaOH濃度對堿溶性多糖提取率的影響

由圖2可知，隨著NaOH濃度的增加，堿溶性多糖的提取率不斷提高，但當(dāng)NaOH濃度大于5%時(shí)，提取率呈現(xiàn)下降的趨勢，因此選擇NaOH濃度5%作為提取牛大力堿溶性多糖的較適條件。

2.2.2 浸提時(shí)間對牛大力堿溶性多糖提取率的影響

浸提時(shí)間分別選取0.5，1，2，3，4和5 h來進(jìn)行浸提，考察時(shí)間對堿溶性多糖提取率的影響，試驗(yàn)條件：溫度50 ℃、NaOH濃度5%、液料比20∶1（mL/g）、提取次數(shù)1次，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，隨著浸提時(shí)間的增大，堿溶性多糖提取率也不斷提高。但增至2 h后，時(shí)間繼續(xù)增加，提取率出現(xiàn)下降的變化，因此選擇浸提時(shí)間2 h作為提取牛大力堿溶性多糖的較適條件。

圖3 時(shí)間對堿溶性多糖提取率的影響

2.2.3 浸提溫度對牛大力堿溶性多糖提取率的影響

溫度分別選取30，40，50，60，70和80 ℃來進(jìn)行浸提，考察溫度對堿溶性多糖提取率的影響，試驗(yàn)條件：時(shí)間2 h、NaOH濃度5%、液料比20∶1（mL/g）、提取次數(shù)1次，結(jié)果如圖4所示。

圖4 溫度對堿溶性多糖提取率的影響

由圖4可知，隨著浸提溫度的升高，多糖提取率也逐漸增大，但超過60 ℃之后，隨著溫度的升高，多糖提取率開始緩慢下降，有可能是因?yàn)闇囟冗^高引起多糖分解等不良影響。因此選擇浸提溫度60 ℃作為提取牛大力堿溶性多糖的較適條件。

2.2.4 液料比對牛大力堿溶性多糖提取率的影響

液料比分別選取10∶1，20∶1，30∶，40∶1，50∶1和60∶1（mL/g）來進(jìn)行浸提，考察液料比對堿溶性多糖提取率的影響，試驗(yàn)條件：時(shí)間2 h，溫度50℃、NaOH濃度5%、提取次數(shù)1次，結(jié)果如圖5所示。

圖5 液料比對堿溶性多糖提取的影響

由圖5可知，隨著液料的增大，堿溶性多糖的提取率也隨之增大，但在液料比增至30∶1（mL/g）后，液料比的增加對堿溶性多糖提取率的影響不大，液料比過大還會(huì)造成溶劑和能源的浪費(fèi)，且會(huì)給后期濃縮過程帶來負(fù)擔(dān)，增加成本，所以選擇液料比30∶1（mL/g）作為提取牛大力堿溶性多糖的較適條件。

2.2.5 提取次數(shù)對牛大力堿溶性多糖提取率的影響

一次浸提并不能將牛大力中的堿溶性多糖完全提取出來，多次浸提可以提高多糖的得率。將第1次浸提并抽濾至干的牛大力殘?jiān)^續(xù)進(jìn)行堿溶性多糖提取，提取條件和第1次浸提的相同，以此類推進(jìn)行第2，第3，第4，第5和第6次浸提，所得濾液合并，濃縮定容后，分別測定其多糖含量，試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。

圖6 提取次數(shù)對堿溶性多糖提取率的影響

由圖6可以知道，堿溶性多糖的提取率隨著提取次數(shù)的增加而增加，二次浸提的多糖提取率顯著高于一次浸提的多糖提取率，但三次及之后多次浸提的多糖提取率與二次浸提的多糖提取率沒有顯著差異，故選用二次浸提作為最終提取方案較為合適。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Design-Expert 12的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以提取溫度（X1）、提取時(shí)間（X2）、NaOH濃度（X3）、液料比（X4）為自變量，以堿溶性多糖得率（Y）為響應(yīng)值進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，得到回歸方程。試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 試驗(yàn)因素和水平

用Design-Expert 12軟件對表2的結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，得到牛大力堿溶性多糖提取率（Y）和提取溫度（X1）、時(shí)間（X2）、NaOH濃度（X3）、液料比（X4）的編碼的二次多項(xiàng)式回歸方程：Y=15.44+0.487 5X1+0.630 0X2+0.505 8X3+0.763 3X4+0.937 5X1X2-0.555 0X1X3-0.985 0X1X4+0.540 0X2X3+0.377 5X2X4+0.917 5X3X4-1.63X12-1.84X22-2.03X32-1.25X42。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

由表3可知，模型的F值為10.34，對應(yīng)的P＜0.000 1，達(dá)到極顯著水平，失擬項(xiàng)P=0.168 4＞0.05，不顯著，說明方程擬合程度良好，可用于牛大力堿溶性多糖提取工藝參數(shù)模型分析。由表3的F值大小順序可知，各工藝條件對牛大力堿溶性多糖提取率的影響大小順序?yàn)閄4＞X2＞X3＞X1，即液料比＞提取時(shí)間＞NaOH濃度＞提取溫度。方差分析表中各因素顯著性分析結(jié)果顯示：溫度（X1）、時(shí)間（X2）、NaOH濃度（X3）、液料比（X4）的一次項(xiàng)及二次項(xiàng)均達(dá)到顯著水平或極顯著水平（P＜0.05或P＜0.01）；交互項(xiàng)X1X2、X1X4、X3X4達(dá)到顯著水平（P＜0.05），其他交互項(xiàng)均不顯著。因此可利用此模型進(jìn)行牛大力堿溶性多糖提取工藝參數(shù)的優(yōu)化分析。剔除不顯著項(xiàng)，得到優(yōu)化后的響應(yīng)面回歸方程：

表3 二次回歸模型方差分析

2.3.2 因素交互作用分析

由方差分析表可知，試驗(yàn)所建立的提取數(shù)學(xué)模型中X1X3、X2X3、X2X4的交互影響較小，X1X2、X1X4、X3X4的交互作用顯著，即提取溫度和提取時(shí)間之間的交互影響對堿溶性多糖提取率有顯著影響，提取溫度和液料比之間的交互影響對堿溶性多糖提取率有顯著影響，NaOH濃度和液料比之間的交互影響對堿溶性多糖提取率有顯著影響，它們交互作用響應(yīng)曲面分別如圖7～圖9所示。

圖7 溫度和時(shí)間交互作用影響

圖9 NaOH濃度和液料比交互作用影響

從圖7可以看出：當(dāng)提取時(shí)間一定時(shí)，提取溫度在50～70 ℃之間變化，堿溶性多糖的提取率先是顯著增大，但到達(dá)一定值時(shí)，又開始慢慢減小；當(dāng)提取溫度一定時(shí)，提取時(shí)間在1～3 h之間變化，堿溶性多糖的提取率先是逐漸增大，到達(dá)一定值時(shí)，又開始慢慢變小。

從圖8可知：當(dāng)提取溫度一定時(shí)，液料比在20∶1～40∶1（mL/g）之間變化，堿溶性多糖的提取率先是顯著增大，但到達(dá)35∶1（mL/g）左右時(shí)，變化趨于平緩；當(dāng)液料比一定時(shí)，提取溫度在50～70 ℃之間變化，堿溶性多糖的提取率先是逐漸增大，到達(dá)一定值時(shí)，提取率緩慢變小。

圖8 溫度和液料比交互作用影響

從圖9可以看出：當(dāng)液料比一定時(shí)，NaOH濃度在4%～6%之間變化，堿溶性多糖的提取率先是顯著增大，但到達(dá)5%左右時(shí)，又開始明顯減小；當(dāng)NaOH濃度一定時(shí)，液料比在20∶1～40∶1（mL/g）之間變化，堿溶性多糖的提取率先是逐漸增大，到達(dá)一定值時(shí)，又開始慢慢變小。

2.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷尿?yàn)證

經(jīng)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，Design-Expert 12軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理后，得到牛大力堿溶性多糖提取的最優(yōu)工藝參數(shù)：提取溫度60.595 ℃，提取時(shí)間2.264 h，NaOH濃度5.245%，液料比34.124∶1（mL/g），預(yù)測的牛大力堿溶性多糖為15.759%。結(jié)合實(shí)際操作的可行性，將最佳工藝參數(shù)修正為提取溫度61 ℃，提取時(shí)間2.3 h（138 min），NaOH濃度5.2%，液料比34∶1（mL/g），在此條件下進(jìn)行牛大力堿溶性多糖提取的驗(yàn)證試驗(yàn)，做3份平行試樣，結(jié)果如表4所示。

表4 最優(yōu)提取條件下牛大力堿溶性多糖的提取率

由表4可知，在此條件下牛大力堿溶性多糖的提取率為15.91%，與模型預(yù)測值基本符合。

3 結(jié)論

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Design-Expert 12的Box-Behnken（BBD）中心組合原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)以及響應(yīng)面分析，建立以提取溫度（X1）、提取時(shí)間（X2）、NaOH濃度（X3）、液料比（X4）為自變量，以堿溶性多糖得率（Y）為響應(yīng)值的多元二次回歸數(shù)學(xué)模型。經(jīng)方差分析和可信度分析，回歸決定系數(shù)為0.911 8，回歸模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)（P=0.168 4＞0.05）不顯著，根據(jù)優(yōu)化的工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，選擇提取溫度61 ℃、提取時(shí)間2.3 h（138 min）、NaOH濃度5.2%、液料比34∶1（mL/g），此時(shí)牛大力堿溶性多糖的提取率為15.91%，與預(yù)測值基本相符，說明采用響應(yīng)面法建立的牛大力堿溶性多糖提取工藝穩(wěn)定可行，可用于牛大力堿溶性多糖的提取。