酶法制備魷魚皮膠原蛋白肽工藝

張國玉，俞存兵，余奕珂，李宣延

遼漁集團(tuán)有限公司（大連 116113）

我國是一個漁業(yè)大國，漁業(yè)資源極為豐富。近些年隨著我國遠(yuǎn)洋漁業(yè)的快速發(fā)展，魷魚產(chǎn)量逐年增加，魷魚在加工過程中，產(chǎn)生大量魷魚皮和魷魚內(nèi)臟的廢棄物。只有少量工廠將其加工為低值水產(chǎn)飼料，大部分工廠均采用掩埋丟棄等方法[1]，造成資源的極大浪費(fèi)。實(shí)際上，魷魚皮中含有大量蛋白質(zhì)，其中含量最多的是膠原蛋白，因此魷魚皮可作為一種新型的膠原蛋白資源[2]。

現(xiàn)代科學(xué)研究證實(shí)，海洋生物蛋白質(zhì)經(jīng)水解后得到的海洋生物活性肽有增強(qiáng)免疫、抗氧化、抗腫瘤、抗菌和抗病毒等活性[3]，在醫(yī)藥、保健品和化妝品等高附加值領(lǐng)域得到應(yīng)用[4-5]。此外，海洋動物蛋白在酶解、低抗原性、低過敏性等方面要優(yōu)于陸地動物蛋白[6-8]。許慶齡等[9]開展熱水提取法、酶解提取法等制備魷魚皮膠原蛋白的工藝研究。林燕等[10]研究發(fā)現(xiàn)利用魷魚皮提取的膠原蛋白肽具有良好的生產(chǎn)加工性能，其抗氧化性、溶解性、泡沫穩(wěn)定性等較為穩(wěn)定，在食品、功能食品和化妝品領(lǐng)域應(yīng)用前景廣泛。試驗(yàn)以秘魯魷魚（Dosidicus gigas）加工廢棄物魷魚皮為原料，選取一種合適酶，優(yōu)化酶解條件，并確立魷魚皮膠原蛋白肽制備工藝，為魷魚皮的高附加值利用提供理論依據(jù)，對于魷魚資源的綜合利用有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

秘魯魷魚皮（遼漁集團(tuán)魚品加工廠）；胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、alcalase蛋白酶（大連聯(lián)合博泰生物技術(shù)有限公司）；其他試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LX-B50型立式壓力蒸汽滅菌器（合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司）；GL-21M高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；UV759CRT紫外可見分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）；FD-1B-50型冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司）。

1.3 工藝流程

秘魯魷魚皮→原料預(yù)處理→熱水提取膠原蛋白→酶解→滅酶→離心分離→真空濃縮→冷凍干燥→膠原蛋白肽粉

1.4 試驗(yàn)方法

取一定量的秘魯魷魚皮，解凍后清洗，將魷魚皮剪成小塊后，分別用一定濃度的NaOH溶液和硫酸溶液浸泡，水洗至中性，勻漿后熱水提取膠原蛋白，調(diào)節(jié)膠原蛋白溶液pH，加入一定量的酶，恒溫酶解，水解結(jié)束后滅酶離心得到酶解液，酶解液經(jīng)真空濃縮凍干得到膠原蛋白肽粉。

1.5 測定指標(biāo)及分析方法

水分：按GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定》測定；灰分：按GB 5009.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測定》測定；總蛋白：按GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》測定；總脂：按GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》測定；總糖：按GB/T 9695.31—2018《肉制品 總糖含量的測定》測定；羥脯氨酸：按GB/T 9695.23—2008《肉與肉制品羥脯氨酸含量測定》測定。

肽及氨基酸：稱取樣品，加入三氯乙酸溶液，混合均勻，靜置10 min，離心取上清液，按GB/T 5009.5測定總蛋白含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 水解用酶的確定

選擇胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、alcalase蛋白酶為水解酶，分別在最適條件下酶解，以肽及氨基酸含量和得率作為評價指標(biāo)，結(jié)果見表1。胃蛋白酶水解后肽及氨基酸含量和得率均較低，木瓜蛋白酶和alcalase蛋白酶水解后得率偏低，而中性蛋白酶和胰蛋白酶水解后肽及氨基酸含量和得率均較高，考慮到酶價格及能耗因素，選擇中性蛋白酶作為水解用酶。

表1 各種酶水解效果的比較

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 料液比對酶解效果的影響

魷魚皮經(jīng)前處理后，分別按料液比1∶2，1∶4，1∶6，1∶8和1∶10（kg/L）提取膠原蛋白，提取后酶解得到膠原蛋白肽粉，以得率為評價指標(biāo)，結(jié)果見圖1。隨著液體占比增加，中性蛋白酶酶解作用充分，得率隨之升高，但液體占比過大時，酶濃度降低，導(dǎo)致得率下降，料液比1∶6（kg/L）時得率最高，因此選取1∶6（kg/L）為最佳料液比。

圖1 不同料液比對得率的影響

2.2.2 不同加酶量對酶解效果的影響

魷魚皮經(jīng)前處理后，按料液比1∶6（kg/L）加水提取膠原蛋白，加酶量分別為600，1 200，1 800，2 400和3 000 U/g，酶解后得到膠原蛋白肽粉，以得率為評價指標(biāo)，結(jié)果見圖2。隨著加酶量增加，酶濃度增加，得率也隨之提高，但得率相差不大，考慮到成本因素，加酶量選擇600 U/g。

圖2 不同加酶量對得率的影響

2.2.3 不同酶解時間對酶解效果的影響

魷魚皮經(jīng)前處理后，按料液比1∶6（kg/L）提取膠原蛋白，酶解時間分別為2，3，4，6，8，16和24 h，以得率為評價指標(biāo)，結(jié)果見圖3。隨著酶解時間延長，得率逐漸提高，后期趨向平穩(wěn)，雖然總體結(jié)果差異較小，但酶解時間短會導(dǎo)致得到的肽粉中肽段多屬于大分子肽鏈，不利于人體吸收，因此酶解時間選擇6 h。

圖3 不同酶解時間對得率的影響

2.3 正交試驗(yàn)

將料液比固定為1∶6（kg/L），選取加酶量、溫度、pH和時間4個因素，以得率和肽及氨基酸含量為評價指標(biāo)，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，見表2。

表2 正交試驗(yàn)因素與水平表

正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。肽及氨基酸含量結(jié)果差異較小，因此選擇得率作為正交試驗(yàn)評價指標(biāo)，極差分析顯示，各因素對得率影響結(jié)果為D＞B＞A＞C，最佳酶解工藝為A2B1C1D2，即加酶量600 U/g、溫度45℃、pH 6.0、酶解時間4 h。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果表

2.4 膠原蛋白肽粉營養(yǎng)成分分析

將秘魯魷魚皮經(jīng)前處理后，按優(yōu)化后確定的酶解工藝得到膠原蛋白肽粉。其感官評價和營養(yǎng)成分分析結(jié)果分別見表4和表5。

由表4可知，該肽粉呈淡黃色粉末狀，具有該產(chǎn)品特有的氣味，無其他異味，符合膠原蛋白肽粉的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求。由表5可知，該肽粉高蛋白且低脂低糖，營養(yǎng)價值較高，肽粉中的羥脯氨酸含量較高，說明肽粉總蛋白中膠原蛋白肽比例較高，達(dá)到膠原蛋白肽粉的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求。

表4 魷魚皮膠原蛋白肽粉感官指標(biāo)

表5 魷魚皮膠原蛋白肽粉營養(yǎng)成分 單位：%

3 結(jié)論

從5種蛋白酶中篩選中性蛋白酶作為魷魚皮水解用酶，通過單因素試驗(yàn)確定熱水提取膠原蛋白的料液比，通過正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化酶解條件，最終確定酶解條件：加酶量600 U/g、溫度45 ℃、pH 6.0、酶解時間4 h。在此酶解工藝條件下得到的肽粉呈淡黃色粉末狀，是一種低脂、低糖、高蛋白的肽粉，營養(yǎng)價值較高，初步達(dá)到膠原蛋白肽粉的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求。

在此酶解工藝下得到的魷魚皮膠原蛋白肽粉雖蛋白含量較高，但其中肽段分子量大小不均一，且灰分較高，因此在后續(xù)工藝優(yōu)化中考慮將魷魚皮膠原蛋白肽酶解液過不同分子量的超濾膜，從而實(shí)現(xiàn)不同分子量的膠原蛋白肽段的梯級分離，同時可降低灰分比重，得到功效更好的產(chǎn)品。