膠質母細胞瘤惡性亞型形成與臨床相關性探討*

艾依丁 呂超 解楊 楊永暢 徐星 金勛

膠質瘤是中樞神經系統最常見的原發性腫瘤。根據2021 年世界衛生組織（WHO）分類指南膠質瘤可分為彌漫型和非彌漫膠質瘤，其中彌漫型膠質瘤占整體的80% 左右，WHO 分級為Ⅱ～Ⅳ級[1]。彌漫型低級別膠質瘤（WHO Ⅱ級和Ⅲ級）根據腫瘤細胞形態可分為星形細胞瘤、少突膠質細胞瘤及間變型膠質細胞瘤，50%患者在手術結合輔助性放療中獲益，中位總生存期8～10 年[1]。彌漫型膠質瘤中，惡性程度最高且細胞形態上表現出高度異質性的膠質瘤稱為Ⅳ級膠質瘤，又稱膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM），其標準治療方案是手術后放療聯合替莫唑胺（temozolomide，TMZ）化療，但標準化治療后的患者5 年復發率高達90%，中位生存期僅15 個月[1]。GBM 的不良預后可歸因于其腫瘤微環境和腫瘤細胞自身的高度異質性導致的放化療反應差異。探究具有放化療抵抗性的腫瘤細胞亞群的形成規律及相關機制，對制定和優化GBM 患者的多模式治療策略有至關重要的作用。本文將圍繞放化療抵抗性亞型腫瘤細胞的形成相關分子調控機制及微環境探討GBM 治療的前景。

1 GBM 的亞型異質性與可塑性

GBM 在細胞形態上表現出高度的異質性：在整體腫瘤組織的基因表達水平上可分為前神經元（proneural，PN）、經典（classical，CL）和間充質（mesenchymal，MES）3 種亞型[2]。以此為基礎的轉錄組亞型分類一定程度上具有預測預后及惡性進展的價值。如在低級別彌漫型膠質瘤中，大部分腫瘤主要表達PN亞型特征，而在GBM 中，3 種亞型比例均衡，并且MES 亞型的患者相比于PN 亞型的患者預后差[3-4]。盡管轉錄組亞型對應的基因突變特點，如PN 亞型中的血小板源性生長因子受體α 多肽（platelet-derived growth factor receptors alpha，PDGFRA）擴增、CL 亞型中的表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變、MES 亞型中的神經纖維瘤病Ⅰ型（neurofibromatosis type Ⅰ，NF1）缺失等現象已有所報道，但在復發GBM 患者中常發生原發性腫瘤的突變基因現象，如EGFRvⅢ丟失或EGFR 減少等[5]。相應于此種突變基因的變化，復發GBM 患者中2/3 患者的基因轉錄譜與原發腫瘤有所不同，有證據顯示大多數原發性PN 亞型GBM 患者在標準化治療后復發時表現出MES 亞型[6]，上述臨床證據說明GBM 亞型的分子特征并非固定不變，而是在治療或疾病進展過程中可能會發生亞型的可塑性變化。

目前，針對膠質瘤分子亞型可塑性變化的原因有兩種解釋：1）高度異質性的GBM 本身具備不同亞型的腫瘤細胞，并在放化療等環境壓力下具有耐受性的細胞存活下來形成腫瘤的主要亞型；2）GBM 中不同亞型的腫瘤細胞在放化療等環境壓力下發生了亞型轉化。實際上，GBM 的大部分單細胞測序結果顯示同一個患者腫瘤組織中3 種亞型腫瘤細胞共存[7-8]，而富含MES 亞型腫瘤細胞的患者預后最差、對放化療抵抗性強[9]，但目前鮮見直接證據證明MES 亞型細胞本身在放化療等環境壓力下生存下來形成腫瘤的主要亞型。因此，不能排除非MES 亞型的腫瘤細胞在放化療等環境因素的影響下發生表觀遺傳重組獲得MES基因表達特性的可能性。事實上，在免疫缺乏鼠原位移植PN 亞型的膠質瘤干細胞（glioma stem cell，GSC）的膠質瘤模型中，經放療后回收的腫瘤細胞其基因表達及細胞特性上表現出MES 亞型的特點，即發生前神經-間充質亞型轉化（proneural-mesenchymal transition，PMT），而這種過程直接導致復發腫瘤對放化療的高度抵抗[10]。無論MES 亞型本身在腫瘤克隆進化中占主導地位，還是非MES 亞型轉化成對放化療有抵抗性的MES 亞型，最終復發的GBM 趨向MES 亞型富集并獲得放化療抵抗性的問題是直接與臨床預后密切相關的腫瘤細胞病理變化[11]。因此，深入了解MES 亞型維持及PMT 相關的分子調控機制對于完善GBM 治療方案至關重要。

2 MES 亞型維持及轉化相關的轉錄調控因子

在真核細胞中，基因的轉錄嚴格受控于結合DNA 轉錄調控區域特異性序列的轉錄因子及其轉錄調控因子。因此，特定細胞的轉錄譜的形成，在機制上依賴于特定的轉錄調控因子參與的分子機制。

2.1 C/EBPβ 和STAT3

GBM 亞型分類的根據是基因轉錄譜，所以早期的MES 亞型研究主要集中在尋找其特異性轉錄因子。針對MES 亞型特異性轉錄調控網絡模擬的研究發現[12]，C/EBPβ 和STAT3 可能對GBM 的MES 亞型轉錄起到重要作用，并通過功能性實驗證明C/EBPβ和STAT3 的共同過表達引起的神經干細胞獲得MES亞型轉錄譜，如YKL40、SMA、Fibronectin、CTGF、OSMR等基因和蛋白的高表達；以及C/EBPβ 和STAT3 共同降表達引起MES 亞型膠質瘤細胞低表達MES 標記基因和蛋白，如YKL40、Fibronectin、CTGF、OSMR 使膠質瘤細胞失去致癌性。基于該研究結果，其提出C/EBPβ 和STAT3 是調控GBM MES亞型特異性基因群的重要轉錄因子這一觀點（圖1A）。

2.2 TAZ

有研究在擴大候選轉錄調控因子前提下重復了Iavarone 團隊的研究[13]。此研究發現由轉錄輔激活因子TAZ 與轉錄因子TEAD 構成的獨立于C/EBPβ 和STAT3 的新MES 亞型特異性轉錄調控網絡（圖1A）[13]。在PN 亞型GBM 和低級別彌漫型膠質瘤中TAZ 啟動子部位高度甲基化，證明DNA 甲基化為主的表觀遺傳調控機制參與GBM 亞型的維持。進一步的功能實驗證明，TAZ 是MES 亞型GBM 特性維持的必要調控因子，而且通過PN 亞型GBM 和低級別彌漫型膠質瘤細胞模型中TAZ 過表達，證明了TAZ 誘導PMT 及膠質瘤惡性進展。

2.3 NF-κB

在原代PN 和MES 亞型GSC 的蛋白表達分析中，發現NF-κB 的激活態蛋白磷酸化P65（p-P65）高表達于MES 亞型GSC，并且調控TAZ、C/EBPβ 和磷酸化STAT3（p-STAT3）的蛋白質表達[10]（圖1A），提示NF-κB 信號通路在MES 亞型維持及PMT 中的重要性。NF-κB 作為重要的炎癥相關轉錄調控因子不僅參與腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、CC 類趨化因子配體2（chemokine CC motif ligand 2，CCL2）、白細胞介素（interleukin，IL）-6 和IL-8等早期炎癥因子的轉錄，并且直接調控MES 相關標記基因，如CD44、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（vimentin）的表達[10，14]，而被NF-κB 轉錄調控的早期炎癥因子以直接或間接的方式激活NF-κB 自身在內的MES 亞型的主要轉錄調控因子，如TAZ、C/EBPβ和STAT3，并形成多環節、多條信號通路的網絡[14]。

圖1 GBM 惡性亞型形成機制

因此，結合GBM 患者樣本實際情況分析MES亞型主要轉錄調控因子的激活機制，才能更好地設計針對性治療方案。

3 腫瘤微環境與MES 亞型

GBM 病理上通常有壞死、血管增生、出血、高密度細胞群、不規則細胞核等特征，上述病理特征伴隨著如氧氣、酸堿度、營養素、細胞因子、基質細胞等，不同程度分布而形成腫瘤微環境。不同的腫瘤微環境影響不同GBM 亞型的轉錄調控因子的表達和激活，并形成不同亞型的選擇性集落。本研究組的前期研究[15]結果也證實，PN 膠質瘤細胞主要分布在腫瘤血管周圍，MES 膠質瘤細胞多分布在腫瘤壞死周圍缺氧區。現主要圍繞影響MES 亞型分布與維持相關的腫瘤微環境進行進一步的討論。

3.1 壞死與MES 亞型

壞死是GBM 的一個代表性病理特征，是腫瘤惡性進展的標志。引起壞死的代表性原因有3 種：1）血液供應、氧氣和營養素無法滿足腫瘤細胞的快速增殖所需，導致局部腫瘤組織區域壞死；2）血栓引起的局部出血及后續的血液凝固，引起血栓周圍細胞壞死；3）放療引起的放射性壞死[16]。但無論何種方式引起壞死，壞死部位周圍普遍伴隨嚴重缺氧環境，并且壞死細胞或周圍的應激性細胞（如衰老細胞）釋放損傷相關模式分 子（damage-associated molecular pattern，DAMPs）如腺苷、高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）、IL-1α、透明質酸（hyaluronan，HA）等于周圍微環境中。而這些DAMP 不僅參與腫瘤微環境的免疫調控，也直接參與MES 亞型轉錄調控因子的激活：如腺苷通過腺苷受體P2X7RB 不僅激活NF-κ 信號通路，還促進放療后GBM 的復發[17-18]；IL-1α 可通過其受體IL1R 激活NF-κB 信號通路；HMGB1和HA 可通過Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）-2和TLR-4 激活NF-κB 信號通路；而且HA 還可以直接結合MES 標記蛋白CD44，激活其下游信號通路，強化MES 亞型基因的表達[16]。上述潛在信號通路揭示了在壞死區周圍富集MES 亞型的原因（圖1A，1B）。

3.2 缺氧微環境與MES 亞型

正常腦組織氧水平在2.5%～12.5%，但在膠質瘤組織中下降至2.4%以下甚至在壞死附近達到0.1%。而在這種缺氧環境可抑制缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1 alpha，HIF-1α）蛋白的降解并發揮其轉錄活性[19]。HIF-1α 不僅可轉錄調控其他癌種上皮細胞-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關轉錄因子ZEB1 的表達，而且通過PLOD1激活NF-κB 活性態p-P65 來誘導GBM 的缺氧環境中的PMT[20]（圖1A，1B）。此外，本研究組前期研究[15，21]發現，缺氧環境中RNF144A 降表達改變BMI1 蛋白的穩定性，而BMI1 通過干細胞因子（stem cell factor，SCF）激活NF-κB 轉錄活性來增強MES 亞型GSC 在缺氧環境中的適應性。缺氧微環境還可以誘導腫瘤細胞特異性的代謝機制，如Warburg 效應，即腫瘤細胞通過Warburg 效應在有限的營養素環境中提高DNA 復制、蛋白質合成所需要的能量三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）和前驅代謝產物產量，此過程中會產生大量的乳酸并形成酸性微環境。而腫瘤酸性微環境又可以維持MES 亞型及引起PMT 發生，并且還具有穩定HIF-1α、激活NF-κB 信號通路的作用[22]。

3.3 炎癥微環境與MES 亞型

GBM 亞型轉錄譜的進一步深度分析顯示，MES亞型腫瘤組織伴隨大量的炎癥相關基因的表達[23]，提示MES 亞型可能伴隨炎癥相關免疫細胞的浸潤。事實上，腫瘤壞死及缺氧部位的DAMP 的沉積及其引起的早期炎癥因子，如集落刺激因子-1（colony stimulating factor-1，CSF-1）、基質細胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor 1，SDF-1）的化學濃度梯度的形成可趨化巨噬細胞、小膠質細胞、中性粒細胞等早期炎癥細胞向壞死及缺氧環境浸潤，而浸潤至腫瘤壞死區域的巨噬細胞在DAMP、SDF-1 等因素的影響下，由抑瘤性M1 轉化成促瘤性M2 進而促進GBM 的惡性進展[17]。實際上，近期單細胞測序結果也證實MES 亞型GSC 占比高的GBM 組織中會富集巨噬細胞和小膠質細胞，而這些GBM 組織中的巨噬細胞和小膠質細胞分泌的制瘤素M（oncostatin M，OSM）通過結合腫瘤細胞白血病抑制因子受體（leukemia inhibitory factor receptor，LIFR）激活STAT3 使腫瘤細胞獲得MES 亞型的特性[24]。炎性環境不但可以引起這種巨噬細胞和小膠質細胞誘導的MES 亞型轉化，還可以招募巨噬細胞，使其分泌TNF-α 在誘導下通過激活NF-κB 信號通路，使PN 亞型轉化成MES 亞型[4，10]。此外，DAMP 和小膠質細胞的刺激下GBM 組織中的星形膠質細胞可以轉化成反應性星形膠質細胞，而這種反應性星形膠質細胞通過IL-6、IL-8 和CCL2 激活腫瘤細胞的NF-κB、C/EBPβ 和STAT3 轉錄調控機制，使其轉化成MES 亞型并對放化療具有抵抗性[25]（圖1A，1B）。

3.4 腫瘤血管形成與PMT 循環

無論腫瘤壞死、缺氧或炎癥細胞的富集均可以導致大量血管形成因子如血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、轉化生長因子-β（transforming growth factor-beta，TGF-β）、PDGF 等分泌至周圍環境，而這些因子不僅招募血管上皮細胞到其微環境中，還促進血管上皮細胞的增殖使其形成GBM特異性的微血管[26]。微血管連接至循環血管時，腫瘤細胞可通過血液獲得充足的氧和營養素。而充足的氧和營養素環境抑制腫瘤細胞的壞死及缺氧區域的形成（圖1C），使PN 亞型的GSC 通過以EZH2 為主的多梳抑制復合物2（polycomb repressive complex 2，PRC2）表觀調控系統適應血管周圍環境并形成PN 亞型區域[15]。當腫瘤血管無法供應PN 亞型腫瘤細胞增殖所需要的氧和營養素時，再次形成局部細胞壞死及缺氧環境，進而發生PMT 過程轉化為MES 亞型。

綜上所述，GBM 的微環境是一個動態循環變化的過程，而此過程帶動GBM 不同亞型分布與轉化的過程。因此，根據GBM 亞型微環境變化機制挖掘適用性微環境調控靶點是控制GBM 惡性進展的關鍵。

4 亞型轉化與臨床治療面臨巨大挑戰

由于GBM 周圍的新生血管異常豐富，采用抗血管生成藥物（如貝伐單抗、舒尼替尼）治療是目前治療GBM 的另一種選擇。然而，目前一項以貝伐單抗為輔助化療藥物的大型前瞻性Ⅲ期臨床試驗結果顯示，標準治療+貝伐單抗治療并未改善GBM 患者的總生存期[27]。究其原因，雖然貝伐單抗的治療對PN 亞型有一定的抑制作用，但這種治療也導致了氧和營養素的供應不足，并局部形成缺氧及酸性等MES 微環境來激活MES 亞型轉錄調控機制，最終復發腫瘤呈現MES 亞型特性[28]。如前所述，TMZ 結合放療的標準化治療導致對放化療有抵抗性的MES 亞型富集并形成MES 亞型復發[10]。但也不能排除放療導致的放射性壞死釋放的DAMP 參與到PMT 并引起的放化療抵抗性（圖1D）。此外，放療引起的DNA 損傷也是GBM 亞型轉化相關領域里被受關注的部分。如當腫瘤細胞暴露于輻射環境時，輻射引起的DNA 損傷可通過共濟失調毛細血管擴張突變基因（ataxia telangiectasia-mutated gene，ATM）激活NF-κB 和C/EBPβ來誘導CD109 表達，在CD109 作用下激活YAP/TAZ轉錄活性誘導發生PMT[14，29]，但這種DNA 損傷情況下被轉化的MES 亞型是否形成新的亞型克隆目前尚不清楚。當然，從GBM 亞型微環境的特異性分布和標準化治療后的微環境變化角度來看，也可以考慮將破壞亞型微環境作為治療GBM 的新策略。近期針對膠質瘤開發的相關巨噬細胞BACE1 信號通路抑制劑MK-8931 能夠將促瘤巨噬細胞轉化為對腫瘤細胞具有攻擊性的抑瘤巨噬細胞[30]，提示針對亞型微環境基質細胞特性轉化的治療有望改善GBM 的惡性進展。

5 結語與展望

GBM 是成人原發性惡性腦腫瘤中十分常見和極具侵襲性的，臨床一線治療平均總生存期為15 個月。一旦治療失敗，預后較差。目前批準用于挽救治療的藥物僅有貝伐單抗，其中位總生存時間為8.7～9.2 個月。貝伐單抗失敗后，生存期約4 個月。因此，GBM迫切需要新的治療方法延長生存期。

目前，雖然已經根據分子亞型的先前鑒定提出了使用個性化治療，但研究表明GBM 可以在一種亞型和另一種亞型之間轉換。此外，每個亞型均可以表達靜止和增殖的細胞亞狀態，這使設計新的治療策略變得困難。同一腫瘤背景下不同細胞亞狀態之間的轉變也可能導致數據誤解，尤其是標記物的表達與特定微環境相關時。因此，明確GBM 惡性亞型形成和轉化機制，從而制定相應的治療策略，是未來GBM 治療的關鍵。