聚合酶Ⅰ和轉錄本釋放因子：一個具有脂質代謝和免疫微環境重構功能的全新膠質瘤標記物*

崔曉騰 康春生

膠質瘤是中樞神經系統最常見的原發性腫瘤，其中膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）為世界衛生組織（WHO）4 級膠質瘤，是發病率和死亡率最高的顱內原發惡性腫瘤，以腫瘤異質性高、惡性進展迅速、放化療不敏感為突出特點。外科手術切除輔以放化療是目前主要的治療手段，但患者預后仍不理想，中位生存期一般不超過1.5 年[1]。隨著二代測序技術的發展和多種分子生物學研究手段的應用，許多腫瘤標志物相繼被鑒定出來，不僅可以作為膠質瘤分子病理分級的關鍵指標，還可在膠質瘤發生發展、放化療抵抗等多種腫瘤生物學行為中起到核心調節作用。如異檸檬酸脫氫酶1（IDH1）蛋白，其R132H 是膠質瘤最常見的原癌突變，但由于引起三羧酸循環受阻，能量生成不足，因此該陽性突變的原發膠質瘤符合低級別膠質瘤的特征[2]；又如O6甲基鳥嘌呤DNA 甲基轉移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）基因的啟動子甲基化狀態，可提示膠質瘤患者對目前一線孤兒化療藥物替莫唑胺的敏感性[3]。

本文所探討的聚合酶Ⅰ和轉錄本釋放因子（polymerase-1 and transcript release factor，PTRF/Cavin-1）是Cavin 蛋白家族的成員之一，廣泛表達于各個組織細胞，在不同的物種中具有高度保守性。PTRF/Cavin-1 最初作為RNA 聚合酶Ⅰ的調節子被鑒定，可通過影響轉錄終止作用促進rRNA 的生物合成[4]，后發現其可與細胞膜內表面定位的小凹蛋白家族（caveolin，CAV）結合[5]，在細胞內吞和外分泌、細胞增殖代謝等多種生理病理過程中發揮重要作用。本文從結構特征和分子互作的角度，系統梳理PTRF/Cavin-1 在膠質瘤研究中的一系列研究成果，明確其在GBM 發生發展中的多面作用，有助于探索針對PTRF/Cavin-1 的膠質瘤靶向干預策略。

1 PTRF/Cavin-1 的結構和功能

蛋白質構象是其發揮生理功能的結構基礎。人類PTRF/Cavin-1 基因位于17 號染色體q21.2，編碼含有310 個氨基酸的蛋白質。隨著蛋白三維構象分析手段的進步，PTRF/Cavin-1 蛋白結構逐漸清晰。目前研究表明，PTRF/Cavin-1 含有3 個亮氨酸拉鏈結構域、2 個核定位信號和1 個出核信號，為PTRF/Cavin-1與其他蛋白相互作用以及全細胞的分布特征奠定了結構基礎。本課題組[6]通過計算機同源建模獲得PTRF/Cavin-1 蛋白的高級結構模型，二級結構多為α 螺旋和環狀結構，且包含長鏈螺旋結構，該結構可促使PTRF/Cavin-1 形成三聚體，以及促進其與Cavin 蛋白家族其他成員（Cavin-2 和Cavin-3 蛋白）的相互作用；殘基分析發現PTRF/Cavin-1 中含有大量親水性殘基，顯示出高親水性；對PTRF/Cavin-1 三聚體蛋白進行結構分析發現，3 個單體之間相互纏繞呈“擰麻花狀”，其N 端互作區域可形成一個帶負電的遠螯腔，深度為25.5 ?，3 個爪顎之間的間隙寬度分別為60.0 ?、52.1 ?和35.0 ?。這種結構使得小凹蛋白CAV1 蛋白帶正電的N 端可以完全嵌入PTRF/Cavin-1 三聚體遠螯腔中，殘基相互形成強大氫鍵（長度為1.7～2.7 ?，鍵角范圍為96.4°～159.0°），靜電表面的完美匹配也穩定了結合構象；在PTRF/Cavin-1 蛋白N 端人為融合1 個TAT 短肽，即可改變其N 端構象和帶電性，同樣影響三聚體N 端遠螯腔的形成和深度，阻礙其與CAV1 蛋白的結合。綜上所述，正確折疊的PTRF/Cavin-1 蛋白對形成三聚體發揮正常蛋白功能十分關鍵。

1998 年Jansa 等[4]首次克隆出PTRF/Cavin-1 蛋白，并證實其參與rRNA 的轉錄終止過程。RNA 聚合酶Ⅰ的轉錄終止需要兩步，首先是轉錄復合物停止延伸，然后是rRNA 前體從轉錄復合物中解離釋放。PTRF/Cavin-1 可與RNA 聚合酶Ⅰ和轉錄終止因子TTF-1 結合，促進停止延伸的轉錄復合物發生解離。有報道提示，PTRF/Cavin-1 還與基因轉錄中RNA 聚合酶Ⅰ的再起始有關，調節rRNA 合成效率，且該過程中PTRF/Cavin-1 可能存在多個位點的磷酸化修飾[7]。

細胞小凹是細胞膜上內陷的直徑為60～80 nm的凹點，與細胞內吞、脂質調節、信號轉導等有關。小凹形成所需的核心組分包括小凹蛋白家族（主要是CAV1）和Cavin 蛋白家族（PTRF/Cavin-1 為必需組分）[8]。CAV1 蛋白經由內質網合成-高爾基體加工后定位在細胞膜內表面，細胞質中的PTRF/Cavin-1 蛋白形成三聚體與之結合并定位于細胞膜上，從而形成細胞小凹。Hill 等[5]通過蛋白質組學手段探明PTRF/Cavin-1 僅可結合細胞膜上成熟的CAV1 蛋白。PTRF/Cavin-1 缺失可導致細胞小凹數量顯著減少，且膜上CAV1 呈現邊緣移動并加速溶酶體降解[9]。同年類似研究發現過表達PTRF/Cavin-1 蛋白可引起細胞小凹增多[10]。

PTRF/Cavin-1 突變/缺失可引起一系列病理性改變，導致疾病發生。2009 年Hayashi 等[11]報道PTRF/Cavin-1 與先天性全身性脂肪營養不良的關系。其發現5 例患者均具有PTRF/Cavin-1 基因突變[c.696_697 insC（p.K233fs），c.525delG（p.E176fs）]，臨床表現為肌肉過度增生、肌肉隆起、輕度代謝并發癥和血清肌酸激酶水平升高，骨骼肌活檢提示慢性營養不良。Rajab 等[12]對8 例患有先天性全身性脂肪營養不良患者進行研究，發現PTRF/Cavin-1 存在純合突變（c.160delG，c.362dupT），臨床表現為長QT 綜合征、心動過緩、室上性心動過速和室性心動過速等病理特征，以及骨形成受損和骨質疏松。建立基因敲除小鼠便于深入探究該蛋白的多種潛在功能。有研究對PTRF/Cavin-1 敲除鼠進行分析，發現其展現出許多病理生理學變化和表現，包括骨骼肌等的細胞小凹水平顯著下降，游離脂肪酸、血清甘油三酯和胰島素水平升高，葡萄糖耐受不良，肺臟炎癥細胞浸潤增加等[13]。

綜上所述，PTRF/Cavin-1 表達與CAV1 在細胞膜上的正確定位對于細胞小凹的形成至關重要，提示PTRF/Cavin-1 與全身脂質代謝有顯著關系。

2 PTRF/Cavin-1 在膠質瘤預后評判中的作用

根據2021 年中樞神經系統腫瘤分類標準，低級別膠質瘤主要包括星形細胞瘤、少突膠質細胞瘤等，伴有IDH 突變、1p19q 聯合缺失等基因組特征；高級別膠質瘤即GBM，其IDH 為野生型，多伴有TERT啟動子突變、7 號染色體擴增聯合10 號染色體缺失等[14]。基于染色體和基因表達差異，GBM 可分為經典型、間質細胞型、前神經元型等不同亞型，其中以間質細胞型的惡性程度最高，患者預后最差。

多項研究表明，PTRF/Cavin-1 的表達水平可提示患者膠質瘤級別。Huang 等[15]通過比較CGGA、TCGA數據庫中收錄的膠質瘤患者測序數據和膠質瘤組織芯片染色，發現PTRF/Cavin-1 的mRNA 和蛋白水平隨著膠質瘤WHO 級別上升而升高，在GBM 間質細胞型中表達最高，高表達PTRF/Cavin-1 提示膠質瘤患者生存期顯著縮短；又通過實驗證實PTRF/Cavin-1受EGFRvⅢ-PI3K-AKT 通路調控，其表達水平與外泌體標志基因CD63 的表達呈顯著相關，腫瘤樣本和血清外泌體中的二者比值可作為膠質瘤患者診斷和評判預后的生物標記物，高級別膠質瘤患者腫瘤組織和血清中的比值均顯著高于低級別膠質瘤。隨后，有研究支持并補充上述結論，不僅確定了PTRF/Cavin-1在預測GBM 患者預后的臨床價值，還發現接受放療的患者中PTRF/Cavin-1 低表達與生存期延長有關，并確定了PTRF/Cavin-1 可促進GBM 血管生成和腫瘤免疫紊亂[16]。

3 PTRF/Cavin-1 促進GBM 增殖和免疫微環境重塑的分子機制

腫瘤生長在一個復雜的環境中，包括原發組織的細胞、代謝、免疫等均與腫瘤發生相互影響。膠質瘤處于人體為數不多的免疫豁免器官，其微環境是腫瘤細胞與顱內固有免疫細胞小膠質細胞、浸潤的巨噬細胞、淋巴細胞、自然殺傷細胞、血管內皮細胞、成纖維細胞等細胞組分和細胞外基質、趨化因子等物質交互調控形成的高度免疫抑制的環境[17]。腫瘤細胞會“教育”周圍其他細胞，使之形成更加利于生長和轉移的微環境。Wang 等[6]發現GBM 中PTRF/Cavin-1 與CAV1結合，增強GBM 細胞外囊泡的合成分泌和攝取，促進GBM 增殖；同時發現PTRF/Cavin-1 驅使的旺盛外分泌可導致小膠質細胞活化和募集。GBM 的高侵襲性是其預后不良的一個關鍵因素，有研究報道GBM中PTRF/Cavin-1 和CAV1 的表達水平均較正常組織顯著升高，且與尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinasetype plasminogen activator，uPA）和明膠酶的表達呈正相關；并發現高表達PTRF/Cavin-1 和CAV1 的GBM細胞（即細胞小凹形成旺盛的腫瘤細胞）可表達更多uPA、基質金屬蛋白酶2 和基質金屬蛋白酶9，且較PTRF/Cavin-1 和CAV1 相對低表達的GBM 細胞（即細胞小凹形成缺陷的腫瘤細胞）更具侵襲性[18]。隨后深入研究發現，高表達PTRF/Cavin-1 的GBM 細胞在滲透壓作用下可增強基質蛋白酶等的表達分泌，增加GBM 侵襲能力以對抗滲透壓力[19]。上述結果表明，PTRF/Cavin-1 可通過細胞小凹促進GBM 惡性行為，重塑GBM 微環境。

代謝重編程為腫瘤提供了充足的能量，以支持其惡性生長以及重塑免疫微環境。作為細胞磷脂代謝的關鍵調控因子，PTRF/Cavin-1 在GBM 發生發展中發揮了重要作用[20]。機制方面，PTRF/Cavin-1 可通過降低胞質磷脂酶A2（cytoplasmic phospholipase A2，cPLA2）泛素化進而穩定其蛋白水平和酶活性，促進磷脂酰膽堿水解為溶血磷脂酰膽堿以增加胞內游離脂肪酸水平，促進線粒體β 氧化和ATP 生成；同時PTRF/Cavin-1-cPLA2 導致的細胞脂質重塑可增加細胞膜流動性，提高GBM 細胞內吞能力；ATP 不僅可以為GBM 增殖提供能量，還可釋放到腫瘤間隙，通過CD73 和CD39 水解為腺苷以抑制CD8+T 細胞的腫瘤殺傷能力，促進GBM 生長和免疫逃逸[20]。

RNA 結合蛋白通過與靶RNA 相互作用在轉錄后水平調節基因表達。Wang 等[21]分析TCGA、CGGA等數據庫中GBM 樣本的RNA 測序數據，構建加權基因共表達網絡，鑒定出8 個與GBM 患者預后相關的RNA 結合蛋白，并進一步實驗證實2 個蛋白可作為GBM 預后標志物，其中就包括PTRF/Cavin-1。隨后，本課題組研究證實PTRF/Cavin-1 的RNA 結合作用，發現其可結合并穩定LncRNA NEAT1，通過激活NF-κB 信號通路來促進GBM 細胞PD-L1 的表達和蛋白膜定位，引起GBM 免疫逃逸[22]。

膠質瘤處于顱內，一般藥物難以透過血腦屏障到達瘤內，目前臨床一線化療藥物僅有替莫唑胺[23]。有研究通過對比GBM 耐藥細胞株和敏感株的蛋白表達變化，發現PTRF/Cavin-1 在耐藥株中顯著高表達，敲低PTRF/Cavin-1 可增強耐藥株對包括替莫唑胺在內的多種化療藥物的敏感性，并降低CAV1 的表達水平，提示PTRF/Cavin-1 與GBM 化療耐藥有關[24]。

4 結語與展望

從1998 年發現并開始首次克隆，針對PTRF/Cavin-1 蛋白的研究從未停止。多年的研究積累，使學者對PTRF/Cavin-1 的功能愈發了解。除本文綜述的PTRF/Cavin-1 在GBM 發生發展中的重要作用之外，其還與葡萄糖攝取、細胞膜修復、細胞衰老等多個生理病理過程有關[9]，在干細胞[25]和其他腫瘤中也多有報道[26-29]。在膠質瘤中，PTRF/Cavin-1 不僅可作為提示預后的標志物，還通過與CAV1 互相作用來促進膠質瘤內吞和外分泌，上調外基質蛋白表達以增加膠質瘤侵襲性，調節膠質瘤脂質代謝和PD-L1 水平來促進免疫逃逸，并與膠質瘤化療耐藥相關。本研究有理由相信，PTRF/Cavin-1尚有很多未發現的功能，其在膠質瘤中的作用也不止如此。因此，靶向PTRF/Cavin-1 有望通過阻斷多條通路，從腫瘤增殖、腫瘤代謝、腫瘤免疫、腫瘤耐藥等多角度抑制膠質瘤惡性行為，增強替莫唑胺敏感性。