血睪屏障與男性避孕

孟志翔 呂金星

1.蘇州大學附屬獨墅湖醫院；2.蘇州大學附屬獨墅湖醫院生殖醫學中心

一、介紹

血睪屏障（BTB）本質是生精小管與睪丸血液之間的一層屏障，由間質的毛細血管內皮基膜、結締組織、生精上皮基膜、生精細胞及支持細胞通過緊密連接、胞質特化、橋粒和縫隙連接等連接復合體相互作用所形成[1-4]。其特有的微觀結構，為精子發生提供了適宜的微環境，并參與調節生物分子的運輸以及作為精子發生的免疫屏障[5]。血睪屏障對男性生育具有重要意義。然而，血睪屏障作為哺乳動物的組織屏障之一，也同樣阻礙了男性避孕藥進入睪丸發揮作用。

研究表明，超過50%的男性有興趣使用可逆性避孕的方法[6]，許多女性也愿意她們的伴侶使用避孕藥[7]。在過去的20年中，激素性避孕藥的研發取得了重大進展[8-9]，例如，注射雄激素（十一酸睪酮）、口服雄激素（十一酸二甲雄酮）、睪酮凝膠或雄激素植入物[10-14]，通過升高血清睪酮水平來干擾下丘腦-垂體-睪丸軸，抑制腦垂體分泌黃體生成素，導致間質中的間質細胞產生雄激素減少，從而影響精子發生，由于下丘腦-垂體-睪丸軸被破壞，男性的其他激素依賴的生物功能（如血壓）和器官（前列腺）以及肌肉質量都可能受到影響，導致產生副作用和男性的擔憂[15-18]，因此開發非激素類男性避孕藥是非常有必要的，在不干擾下丘腦-垂體-睪丸軸和血清睪酮水平的情況下，更好地在睪丸中發揮作用。近期關于血睪屏障中藥物動力學以及其他新興技術的研究，為男性避孕藥提供新的作用靶點和新前景。

二、血睪屏障的結構和功能

（一）血睪屏障的結構

血睪屏障主要是由支持細胞之間的緊密連接、胞質特化、橋粒和縫隙連接組成的[3-4]，睪丸內的緊密連接與胞質特化共存并共同發揮作用。橋粒和縫隙連接存在于包含緊密連接和基底胞質特化的質膜區域之間。

緊密鏈接由相鄰的支持細胞構成，支持細胞呈錐體形，形狀不規則，細胞基部緊貼基底膜，頂部可以到達生精小管的管腔，細胞側面和腔面凹凸交錯，相鄰細胞間鑲嵌著各級生精細胞，細胞側面近基部的相鄰細胞膜形成緊密連接。緊密連接的膜整合蛋白有許多種類，其中能夠調節緊密連接動力學以及能夠影響精子發生的蛋白主要有4類：Occludin蛋白、Claudin蛋白、JAMs家族（Junctional adheson molecules）、ZO（Zona Occludens）蛋白[19]。

胞質特化，即睪丸特異的黏附連接，由位于質膜和內質網池之間的六角形排列的絲狀肌動蛋白微絲組成。支持細胞之間的外質特化被定義為基底的外質特化，而支持細胞和成形的精子細胞之間的外質特化被定義為頂端的外質特化[20-21]。胞質特化介導的粘附在很大程度上是由鈣粘連蛋白-連環蛋白多功能復合體構成的，該復合體還調節肌動蛋白細胞骨架并促進細胞極性[22-23]。

橋粒是介導強力黏附的細胞-細胞連接，而縫隙連接是細胞-細胞通道，允許代謝物、第二信使、離子和其他小于1KDa的分子擴散[24-25]。緊密連接、胞質特化和縫隙連接附著于肌動蛋白微絲[20,26]，而橋粒附著于中間絲[20]。

（二）血睪屏障的功能

1.為生精上皮周期提供不同的微環境：血睪屏障中的緊密連接將生精上皮分隔成基底室和近腔室，基底室靠近基膜，其內有A型精原干細胞（包括Asingle（As）、Apaired（Apr）和Aaligned（Aal）型精原干細胞。）、B型精原細胞以及初級精母細胞（即前細線期精母細胞）。近腔室內，精母細胞接連發生兩次減數分裂以發育成精子細胞，最終經過分化形成正常的蝌蚪狀精子進入曲細精管管腔。

2.調控各類生物分子的轉運：在睪丸中，精子發生所需的營養物質（例如糖類和氨基酸）、重要分子（例如激素和電解質）以及危害精子發生的有害毒物（例如環境、毒物、藥物和化學品）都位于生精小管之間的間質。血睪屏障的動態開合可調控這些物質進入減數分裂期和分裂后期的生殖在近腔室內發生形態變化。因此，可為精子發生創建了一個適宜的微環境[1]。

3.構建免疫屏障：確保免疫系統不能識別存在于生殖細胞表面的特異性抗原。最近的研究表明，支持細胞和生殖細胞通過產生干擾素（interferon，IFN）、白介素（interleukins，ILs）和細胞因子來維持獨特的防御系統。血睪屏障也阻止免疫球蛋白和淋巴細胞進入近腔室[27-29]。

4.賦予生精上皮極性：血睪屏障通過CRB（Crumbs）-PALS（protein associated with Lin Seven）-PATJ（Pals associated tight junction protein）、PAR3（partitioning defective 3）-PAR6-aPKC、DLG（Scribble Discs large）LGL（Lethal giant larvae）三種細胞極性復合體共同作用，賦予生精上皮細胞極性[30-31]，參與生精細胞遷移，在生精細胞遷移過程中起導向作用，從而保證生精細胞在生精小管內遷移方向的正確性[32-33]。

三、血睪屏障與藥物運輸

睪丸活體研究中發現，血睪屏障組成中存在藥物轉運體及幾種生物活性多肽。這些結構調節血睪屏障的功能，促進藥物通過血睪屏障，這些觀點可應用于非激素類男性避孕藥adjudin（即1-（2，4-dichlorobenzyl）-1H-indazole-3-carbohydra-zide）的研究[34]。

（一）藥物轉運體

以男性避孕藥adjudin為例，血睪屏障對其生物利用度有顯著影響，阻礙了藥物從生精上皮的間質間隙轉移到腺腔內。這在很大程度上是由于支持細胞在血睪屏障存在強勢表達的藥物轉運體，主要為ATP結合盒（ATP Binding Cassette，ABC）轉運體，如P-糖蛋白和多藥耐藥相關蛋白1（Multidrug Resistance-associated Protein 1，MRP1），它們存在于支持細胞、生殖細胞、管周肌樣細胞以及構成間質微血管的內皮細胞的質膜上[1,35-36]。此外，ABC轉運體中的乳腺癌耐藥蛋白（Breast Cancer Resistance Protein，BCRP）在固有層的管周肌樣細胞和間質的微血管內皮細胞中也有很強的表達[35-36]。這些藥物轉運體均具有外排藥物的作用，并且彼此之間協同工作。如果外源性藥物以某種方式通過特定的藥物轉運體（如藥物流入泵）穿透血睪屏障，它們就會積極地將外源性藥物從睪丸中泵出，阻止藥物進入生精上皮，從而限制藥物在睪丸中的生物利用度。因此，可以在當前研究的基礎上開發出針對藥物轉運體的制劑，減少藥物轉運體的“外泵”作用，從而擴大藥物療效。

（二）內源性生物活性肽及其下游信號蛋白

在精子發生過程中通過對頂端胞質特化和基底膜的組成蛋白水解產生幾種生物活性多肽，這些多肽可以通過下游信號蛋白有效地調節血睪屏障的功能，促進男性避孕藥通過血睪屏障的運輸。

第一個是來源于層粘連蛋白-γ3的F5肽[37-38]。F5肽通過干擾支持細胞在血睪屏障上的粘附功能來誘導血睪屏障的重塑[37]，還加強了頂端胞質特化的分解，以促進精子在受精過程中的釋放[37-38]。

第二個生物活性肽是NC1（noncollagenous 1）肽，NC1肽通過mTORC1（manmalian torget of rapamycin complex 1）和下游信號轉導核糖體蛋白S6（即rpS6）[39]以及抑制Akt1/2（類似于蛋白激梅B）[40]的作用來發揮其功能，從而擾亂纖維肌動蛋白和微管的組織，加速基底胞質特化及頂端胞質特化的退變和重構[40]。

第三個可以調節血睪屏障功能和頂端胞質特化功能的生物活性肽是層粘連蛋白球狀域3/4/5（Lg3/4/5）肽，研究表明，Lg3/4/5肽與NC1肽類似，通過mTORC1/rpS6/Akt1/2信號復合體發揮下游作用[41]。

這三種生物活性肽的聯合作用使生精上皮中的胞質特化具有可塑性，促進生精上皮中發育的生殖細胞在生精上皮周期中及時運輸，并調節血睪屏障的結構和功能。

四、男性避孕藥的最新進展

目前，有幾個候選化合物正在被研究者們積極研究，其中adjudin和加馬達唑似乎是兩個很有前景的先導化合物[42]。這兩種藥物都是氯硝胺的衍生物，已知通過破壞生殖細胞（大鼠睪丸中的第8-19步精子細胞）和支持細胞之間的睪丸特異性非典型粘附連接，即頂端胞質特化，可誘導生精細胞可逆性脫落[43]。根據一項使用adjudin的研究，在雄性大鼠口服adjudin后，只有不到1%的adjudin可以到達睪丸[44]，顯示出相對較差的生物利用度，跨血睪屏障運輸藥物的新發展將有助于開發出新型的非激素類避孕藥。

（一）細胞旁入路途徑

細胞旁途徑指特定物質通過細胞之間的緊密連接進入細胞間隙而被吸收的過程[45]。通過該途徑增加藥物吸收的研究已取得較大的進展。小干擾RNA（Small Interfering RNA，siRNA）、中鏈脂肪酸、抗體和多肽等試劑均顯示了良好的調節效果[37,46-47]。據報道，許多多肽通過靶向支持細胞整合膜蛋白的胞外結構域來干擾緊密連接的通透性功能。例如，與大鼠Occludin蛋白的第二細胞外環的一段序列相對應的22個氨基酸的肽，已知能在體外和/或體內誘導支持細胞緊密連接屏障的可逆性破壞[48]。

來自層粘連蛋白-γ3鏈的、被命名為F5肽的生物活性多肽，在睪丸內注射時也能對血睪屏障發揮作用，并加強頂端胞質特化的破壞，從而有效地誘導生殖細胞脫落[37]。F5肽與adjudin聯合使用，這種方法可以顯著降低adjudin的有效劑量，以提高其生物利用度，該藥物在血睪屏障背后發揮避孕作用。更重要的是，F5肽在體外和體內對血睪屏障的破壞性影響是可逆的，其長期健康風險應該是最小的，因為這是一種內源性產生的生物分子[49]。研究表明使用該方法后，大鼠40天足以恢復生育能力[49]。

此外，通過下調緊密連接的整合膜蛋白（如ZO-1、occludin和claudin）的表達來調節血睪屏障通透性。使用特異性siRNA或短發夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）來提高藥物生物利用度，似乎是一種可行的方法。研究表明，在對claudin-5進行siRNA修飾后的[48]小時內，小鼠血腦屏障被短暫和可逆性打開；通過一系列示蹤分子實驗和磁共振成像（MRI），雖然敲除claudin-5會損害血腦屏障的功能，允許小分子物質透過，但屏障仍然可以形成，大分子的抗精子抗體依舊難以通過，完全發育的成年小鼠沒有顯示出明顯的副作用[50]。因此在未來的研究中可考慮男性避孕藥與siRNA鏈結合的給藥方法在血睪屏障中發揮作用。

（二）跨細胞方法

此方法主要是通過增加細胞對藥物分子的攝取，從而跨過組織屏障提高生物利用率，具體包括以下幾種方法：

1.微粉化技術是最廣泛使用的方法，它大大減小了藥物顆粒的大小，使藥物可以很容易地穿透靶器官的細胞膜。過去十年中超臨界流體（SCF）技術被廣泛研究。早期的超臨界流體技術用于生產粒徑約0.7-5.0μm的顆粒。最近的SCF能夠獲得納米級的藥物顆粒，例如“粒徑”＜300nm，從而顯著提高不同藥物的溶解度和口服生物利用度[51]。使用SCF-CO2方法，可以生產更穩定、更均勻的脂質體，作為更好的藥物載體[52]，未來可將幾乎不溶于水的adjudin包埋在脂質體中，或利用超臨界流體技術制備均勻細小的adjudin微粒，以提高其生物利用度和有效性。

2.反式轉錄激活因子（TAT）序列，本質是一種11個氨基酸的肽，稱為蛋白質/肽轉導結構域（Protein/Peptide Transduction Domain，PTD），也被稱為細胞穿透肽（cell penetrating peptides，CPPs）[53-54]。目前研究認為，藥物可通過PTD結合到質膜上，然后通過胞內囊泡介導的內化，將藥物釋放到細胞胞漿內[54]，類似于血睪屏障中的內吞囊泡介導的轉運事件。簡而言之，adjudin或其他男性避孕藥結合PTD是男性避孕藥跨越血睪屏障的一種新的替代方法。

3.此外，納米技術的發展也為男性避孕藥通過血睪屏障帶了曙光。納米粒子的粒徑在1～1000 nm，已被廣泛運用于輸送多種治療藥物，主要作為抗癌藥物的載體。傳統的藥物分子要么連接到納米粒子的表面，要么包裹到納米核心中，被運送到靶器官以提高療效。這些納米粒子主要設計用來運輸水溶性低或容易被酶分解的藥物[55]。納米粒子通常由脂類、金屬材料、聚合物、納米晶體、介孔材料等組成。其中，介孔材料正在成為男性避孕藥物的新興載體。其中研究最多的是介孔二氧化硅納米粒子（Mesoporous Silica Nanoparticles，MSN）[56]。MSN通過胞內囊泡介導的途徑[57]或GTP酶介導的巨噬細胞吞噬進入細胞[58]。給小鼠睪丸靜脈注射無定形納米二氧化硅顆粒，被證明可以穿透支氣管束，并導致支持細胞和生殖細胞（例如，精母細胞）中納米顆粒的積累，而不會造成睪丸損傷[59]。此外，還可以使生物活性藥物在到達靶細胞/組織之前不會被酶降解，因為其表面不能被體循環和組織（例如腸道）中的酶所利用[60]。因此，男性避孕藥有可能被加載到MSN的六邊形排列的中孔中，以供口服，而不需要使用注射，避免了腸外給藥，提高了可接受性。

五、總結和展望

我們總結了血睪屏障的相關結構組成和生物學功能，并討論了非激素男性避孕藥如何更好穿越血睪屏障，如藥物轉運體、生物活性肽以及跨越血睪屏障的新技術，如siRNA和納米顆粒運輸等，這些方法在減少藥物副作用和提高藥物生物利用度方面都顯示出明顯的優勢。

然而，男性避孕藥的臨床研發和推廣目前仍存在部分挑戰。例如，對于不同種族、不同年齡的男性對同一種避孕藥的反應是否完全相同；服用避孕藥之后的男性停藥后是否能夠迅速且完全地恢復生育能力；如何安全有效地在臨床上進行藥物試驗。同樣的，在保證藥物安全有效的前提下，我們仍需要保證藥物成本控制在大眾可接受范圍之內。盡管在未來還有很多問題需要很多研究，但血睪屏障的進展已經為開發新的睪丸給藥方法帶來了新的曙光。

關鍵詞血睪屏障； 避孕藥，男用； 藥物釋放系統；納米技術

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2022.02.020

中圖分類號R339.211； R698.9； R979.21