胰腺癌中橋粒斑菲素蛋白3基因和蛋白的表達及其功能的生物信息學分析

裴 磊 節陽華 胡 悅 朱 玲 王 寧

胰腺癌(pancreatic cancer)作為最為常見的消化道腫瘤，發病率連年上升，5年生存率僅9%[1-2]，其高死亡率與不典型的早期癥狀和極易發生肝臟轉移有關。近100年，腫瘤治療在靶向、免疫等方面日新月異，許多患者因此而受益，甚至得到根治，但仍有部分患者因就診晚，缺乏有效的治療方法，治療效果較差。目前國內外醫學研究者展開了多項實驗，試圖獲得治療胰腺癌的新診治靶點。橋粒斑菲素蛋白3(Plakophilin 3,PKP3)可以影響細胞信號轉導和細胞粘附，在腫瘤發生中起重要作用。PKP3蛋白已被證明在多種癌癥中發揮作用,如乳腺癌、下咽癌、胃癌、黑色素瘤及其他類型腫瘤，但目前尚無研究闡述PKP3在胰腺癌中的分布與其生物學功能。本研究通過生物信息學分析PKP3蛋白在不同組織、不同期別胰腺癌組織中的表達，與胰腺癌患者預后的關系及其發揮的生物學功能，闡述其在胰腺癌發生、發展過程中發揮的作用。

1 材料與方法

1.1 PKP3在胰腺癌中的表達及其對生存預后影響的分析

GEPIA數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn,GEPIA database)是目前我國在利用TCGA數據做可視化分析上,比較著名的一款在線工具。打開數據庫，在搜索欄中輸入PKP3,在樣本數據庫中選擇胰腺癌(PAAD),分析PKP3蛋白在胰腺癌組織、癌旁組織的表達差異，及其在不同臨床分期胰腺癌組織中的表達水平。繼續使用GEPIA 數據庫深層次分析PKP3蛋白與胰腺癌患者的總生存期(overall survival,OS)及無疾病進展生存期(disease free survival,DFS)的關系。參照PKP3蛋白的表達水平的中位數,將數據庫中的胰腺癌患者分為高表達組及低表達組,對兩組患者進行生存預后分析。

1.2 觀察PKP3蛋白在胰腺癌組織和正常胰腺組織中的表達差異

The Human Protein Atlas數據庫(http://www.proteinatlas.org)是收集各地研究員在實驗室中使用特殊的抗體，用免疫組化染色方法顯示蛋白在不同組織中的表達圖像，用來分析某種蛋白在腫瘤組織與癌旁組織表達的差異。本研究使用該數據庫中的圖像數據，觀察PKP3表達差異。

1.3 PKP3蛋白相互作用網絡及功能分析

應用String數據庫(http://string-db.org/)與WebGestalt(http://www.webgestalt.org/)數據庫分析與PKP3蛋白關系緊密的蛋白，記錄排在前10的蛋白，繪制網狀圖及分析它們與PKP3蛋白的相互作用關系。

1.4 統計學方法

應用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析。采用t檢驗驗證胰腺癌組織和癌旁組織中PKP3的表達差異;利用F檢驗分析不同期別胰腺癌PKP3的表達;采用Kaplan-Meier法計算PKP3的表達水平與胰腺癌患者預后的關系。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胰腺癌組織與癌旁組織及不同期別胰腺癌組織中PKP3蛋白的表達比較

收集GEPIA數據庫中的350例標本(179例胰腺癌組織標本及171例正常胰腺組織標本),經統計學方法整理分析后發現胰腺癌組織中PKP3蛋白表達水平顯著高于癌旁組織(P<0.01),如圖1所示。更深入地分析不同病理期別胰腺癌組織中該基因的表達,發現病理分期Ⅰ～Ⅳ期胰腺癌組織中該基因表達差異并無統計學意義(HR=1.4,P=0.034),如圖2所示。

圖1 PKP3蛋白在胰腺癌組織和癌旁組織的表達情況

圖2 不同分期胰腺癌組織中PKP3蛋白表達比較

2.2 胰腺癌中PKP3 蛋白表達與患者預后的關系

利用 GEPIA 數據中胰腺癌患者的生存數據進一步分析,以PKP3蛋白表達的中位數為標準,將數據庫中胰腺癌患者分為PKP3 蛋白高表達組和低表達組,與低表達組比較,PKP3蛋白高表達患者OS明顯縮短(HR=1.4,P=0.034),而DFS比較差異無統計學意義(HR=1,P=0.890),見圖 3、4。

圖3 PKP3蛋白表達與胰腺癌患者OS的關系

2.3 胰腺癌組織和正常胰腺組織中PKP3蛋白表達水平比較

基于The Human Protein Atlas 數據庫分析胰腺癌

圖4 PKP3 蛋白表達與胰腺癌患者DFS的關系

組織和癌旁組織中PKP3 蛋白分布情況。分析得出PKP3蛋白在癌旁組織與胰腺癌組織中均主要定位于囊泡和細胞膜,染色呈藍紫色。但在胰腺癌組織中染色明顯較深，如圖5。

2.4 PKP3的生物信息學分析

在String 數據庫中對與PKP3相關聯的蛋白進行生物信息學分析,發現了10 個與PKP3在功能及定位上相關的蛋白,包括DSG1、DSG3、DSG4、DSC1、DSC2、DSC3、DSP、JUP、PPL、DSG2(圖5),利用WebGestalt進一步對這些蛋白分析發現,這些蛋白主要構成細胞膜、囊泡等細胞結構。參與多細胞生物進程、細胞發展過程等過程,發揮結合蛋白質、結合離子等功能。

圖5 PKP3功能及定位相關蛋白

3 討論

Plakophilins(PKPs)蛋白家族包括PlakoF(PKPl)、Plakophilin 2(PKP2)及Plakophilin 3(PKP3)，同屬于細胞黏附分子P120ctn家族，其共同特點為分子結構中具有特征性的Armadillo重復序列，具體為45個氨基酸，且與P120ctn該序列的相似50%。PlakophilinsmRNA主要存在于橋粒，對細胞橋粒的組成及功能維持有重要作用[3]。PKP3表達異常引起細胞黏連的缺失，繼而導致腫瘤細胞處在高活性及高侵潤性，使部分腫瘤細胞從原發腫瘤中分離，實現腫瘤轉移。Aigner[4]與Papagerakis[5]完善實驗證實PKP3的低表達與口腔癌及結腸癌的進展及轉移有關。Li等[6]認為在鼻咽癌組織中，PKP3受miR-149的負向調節，與鼻咽癌的轉移關系密切。但能否通過調整PKP3表達水平控制腫瘤轉移暫無報道，仍需后期實驗證實。 PKP3存在于細胞間橋粒組織中,是一種細胞間黏連蛋白,是細胞間黏連的主要組織,它與細胞橋粒的粘附構成了細胞間的連接[7]?，F有研究證實在不同來源、不同組織病理學分期腫瘤組織與對應的癌旁組織之間的PKP3基因的表達模式存在差異,Papagerakis等[8]發現在口咽小細胞癌中,PKP3表達與腫瘤組織學分期呈負相關。Schwarz等[9]發現PKP3基因在腫瘤細胞中的表達明顯高于正常胰腺組織,與本研究一致。綜上所述,PKP3基因表達異常與腫瘤發生密切相關。 本課題研究178例胰腺癌患者總體預后時發現：高表達PKP3基因的胰腺癌患者總體生存時間、無進展生存時間明顯縮短。有前期研究發現，在肺癌、胃癌、宮頸癌患者中，PKP3基因高表達明顯降低患者生存時間[10-12]，與本研究一致。說明PKP3基因與腫瘤患者的生存時間密切相關。且有研究證實:PKP3的表達很有可能與淋巴結轉移及腫瘤大小密切相關[13]。國外有報道通過調低PKP3表達后發現連接細胞橋粒體積縮小、細胞間粘附性下降，促進腫瘤細胞增長及轉移[14]。而本研究結論提示高PKP3表達同樣明顯降低患者生存時間，推測原因可能因為：在腫瘤外因驅使下，細胞粘附蛋白排列紊亂，細胞橋粒體積過小，兩者喪失粘附作用，導致腫瘤局部進展及轉移。通過String及WebGestalt數據庫對PKP3及相關蛋白分析顯示,與PKP3蛋白相關的功能蛋白主要位于細胞膜、囊泡等膜性結構中,參與多細胞生物進程、細胞發展過程等過程,在結合蛋白、離子等過程中發揮著重要作用,但其具體功能有待進一步驗證。

以往的實驗研究方法一次僅能研究少數或幾個基因,但隨著測序技術的不斷的改進和升級及基因組學和蛋白組學的大規模應用,產出的研究成果翻了幾倍。如今的公共數據庫整合了多項研究成果,利用當前的生物信息分析技術對公共數據庫中的海量信息進行整合分析,更有利于從多個角度探索某個或某些基因與疾病的內在聯系,為更深層次了解疾病打下基礎。使用公共數據庫進行初步分析，后期結合體外實驗進行驗證及擴展，已成為現如今科研新方向。

PKP3蛋白存在于生物體內幾乎所有器官中，在不同腫瘤組織中表達水平各不相同，但其表達差異引起細胞間黏性改變，繼而引起腫瘤進展及轉移。本研究通過多個生物數據庫得出結論：在胰腺癌組織中PKP3蛋白呈高表達,其表達水平與患者不良預后呈正相關,PKP3蛋白參與多種生物學過程,有希望成為胰腺癌診斷和治療的新靶點,但其在胰腺癌發生發展中的具體功能有待進一步體內外實驗探究。