pro-GRP和Napsin A在肺癌組織中的表達(dá)水平及與臨床預(yù)后的關(guān)系

張文靜 張光亮 蘇亞麗 齊 林

肺癌是世界上診斷率最高的癌癥，也是最常見的癌癥死亡原因[1]。根據(jù)GLOBOCAN 2020全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，肺癌占全世界所有新增癌癥病例的11.4%，僅次于乳腺癌，18%(180/1000萬例)的全球癌癥相關(guān)死亡是由肺癌引起的[2]。據(jù)估計，2035年肺癌死亡病例將增加至300萬[3]。盡管非侵入性診斷技術(shù)的進(jìn)步提高了發(fā)現(xiàn)肺癌的可能性，但仍然只有10%～15%的病例是在臨床早期診斷，75%的患者確診時已處于肺癌晚期，患者預(yù)后較差[4]。因此，肺癌的早發(fā)現(xiàn)和早診斷對于改善患者臨床預(yù)后至關(guān)重要。胃泌素釋放肽前體(progastrin-releasingpeptide，pro-GRP)是胃泌素釋放肽(GRP)的前體，GRP是一種參與生理消化過程的胃腸激素，GRP、pro-GRP二者均與肺癌在內(nèi)的腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。天冬氨酸肽酶A(Napsin A)在肺腺癌的診斷中有著廣泛的應(yīng)用，是原發(fā)性肺腺癌的一種特異標(biāo)志物[6]。本研究通過檢測pro-GRP和Napsin A在肺癌組織及其癌旁組織中的表達(dá)水平，分析二者陽性表達(dá)率與肺癌臨床預(yù)后的關(guān)系，旨在為更加深入闡明pro-GRP和Napsin A在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用奠定理論基礎(chǔ)及為肺癌的治療及臨床預(yù)后評估提供參考根據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年2月至2018年2月醫(yī)院收治的93例肺癌患者，并收集手術(shù)切除的癌組織標(biāo)本及其相應(yīng)的癌旁組織(距離腫瘤邊緣5 cm以上的正常組織)標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)術(shù)后病理明確診斷為肺癌；②術(shù)前未接受任何抗癌治療，包括放療、化療以及靶向藥物治療等；③臨床及隨訪資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位惡性腫瘤者；②排除遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者；③嚴(yán)重功能器官障礙者。93例肺癌患者中，包括男性患者57例，女性患者36例，年齡50～83(66.09±7.48)歲；54例腺癌，24例鱗癌，15例小細(xì)胞肺癌；臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期40例，Ⅲ期53例；分化程度：低中分化52例，高分化41例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48例。患者均對本研究知情，且本研究獲得了醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)及通過。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 收集全部肺癌患者臨床資料，統(tǒng)計患者性別、年齡、腫瘤大小、病理類型、臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及隨訪3年的生存情況，末次隨訪時間為2021年2月。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 收集全部患者癌組織標(biāo)本(肺癌組)及距離腫瘤邊緣5 cm以上的正常肺組織標(biāo)本(對照組)，癌組織經(jīng)術(shù)后病理明確診斷為肺癌。癌組織標(biāo)本與癌旁組織標(biāo)本經(jīng)10%甲醛溶液固定，常規(guī)酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，并制成4 μm層厚的切片。采用免疫組織化學(xué)染色法檢測標(biāo)本中pro-GRP和Napsin A表達(dá)水平，具體操作步驟如下，將切片置于PH6.0的檸檬酸鹽緩沖液(0.01 mmol/L)中進(jìn)行高溫高壓抗原修復(fù)，時間2 min，待切片冷卻后使用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，加入一抗[pro-GRP(1∶100)、Napsin A(1∶50)]，4 ℃條件下中孵育過夜；使用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，加入二抗溶液，37 ℃條件下孵育30 min，使用磷酸鹽緩沖液沖洗3次；DAB顯色、蘇木精復(fù)染、中性樹膠封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察pro-GRP和Napsin A表達(dá)情況。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定 由兩位高年資病理科醫(yī)生獨立觀察免疫組織化學(xué)染色后的切片，若存在不同意見則由兩位共同商議并最終確定。每張切片隨機(jī)選取5個高倍鏡視野進(jìn)行觀察(400×)，染色強度評分：無染色記作0分，淺黃色記作1分，棕黃色記作2分，棕褐色記作3分。陽性細(xì)胞占百分比評分：無陽性細(xì)胞記作0分，陽性細(xì)胞<10%記作1分，陽性細(xì)胞10%～50%記作2分，陽性細(xì)胞>50%記作3分。以染色強度評分與陽性細(xì)胞占百分比評分相加作為最終染色評分，0～2分表示陰性表達(dá)，3～6分表示陽性表達(dá)。

1.3 觀察指標(biāo)

比較癌組織及癌旁組織中pro-GRP和Napsin A表達(dá)陽性率；比較pro-GRP、Napsin A陽性表達(dá)和陰性表達(dá)肺癌患者臨床病理特征；分析pro-GRP和Napsin A表達(dá)水平與肺癌患者臨床預(yù)后的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計數(shù)資料以例數(shù)(n)或百分比(%)表示，比較進(jìn)行χ2檢驗；采用單因素和多因素Cox回歸模型分析影響肺癌患者臨床預(yù)后的獨立危險因素，以P<0.05表示數(shù)據(jù)之間的比較具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pro-GRP、Napsin A在癌組織及癌旁組織中的表達(dá)水平

肺癌組pro-GRP陽性表達(dá)率顯著高于對照組(P<0.05)，Napsin A陽性表達(dá)率顯著低于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 pro-GRP、Napsin A在癌組織及癌旁組織中的表達(dá)水平(例，%)

2.2 pro-GRP、Napsin A在肺癌中的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

pro-GRP陽性表達(dá)與肺癌患者腫瘤大小、臨床分期、分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，Napsin A陽性表達(dá)與肺癌病理類型、臨床分期、分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。見表2。

表2 pro-GRP、Napsin A在肺癌中的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系(例，%)

2.3 pro-GRP、Napsin A表達(dá)水平與肺癌患者臨床預(yù)后的關(guān)系

隨訪3年，全部患者均獲得隨訪，其中死亡62例，生存31例。死亡組pro-GRP陽性表達(dá)率顯著高于生存組(P<0.05)，Napsin A陽性表達(dá)率顯著低于生存組(P<0.05)。見表3。

表3 pro-GRP、Napsin A表達(dá)水平與肺癌患者臨床預(yù)后的關(guān)系(例，%)

2.4 pro-GRP、Napsin A表達(dá)水平與肺癌患者臨床預(yù)后的多因素Cox分析

單因素分析結(jié)果顯示，臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及pro-GRP、Napsin A表達(dá)水平與肺癌患者臨床預(yù)后有關(guān)；多因素Cox風(fēng)險回歸分析顯示，分化程度(γ=1.955，95%CI：1.313～2.916，P=0.002)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(γ=2.584，95%CI：1.509～4.407，P=0.001)、pro-GRP表達(dá)水平(γ=1.581，95%CI：0.872～2.653，P<0.001)、Napsin A表達(dá)水平(γ=2.063，95%CI：1.429～2.989，P<0.001)是影響肺癌患者臨床預(yù)后的獨立因素。見表4。

表4 影響肺癌患者生存預(yù)后的單因素和多因素Cox分析

3 討論

目前，肺癌仍然是癌癥死亡的主要原因，我國肺癌發(fā)病率及死亡率依舊遙居所有惡性腫瘤首位，且在年輕人中的發(fā)病率呈上升趨勢[7-8]。肺癌的臨床治愈率較低，大部分患者在進(jìn)行手術(shù)治療后仍存在疾病復(fù)發(fā)的可能性，患者臨床預(yù)后不甚理想[9]。因此，深入了解肺癌的致病機(jī)制，并探索肺癌潛在的治療靶點以及臨床預(yù)后預(yù)測因子具有重要的意義。

GRP是一種蛙皮素類似物，有報道指出，小細(xì)胞肺癌腫瘤細(xì)胞能夠合成和釋放GRP，并與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)[10]。GRP不穩(wěn)定，半衰期短(2 min)，而pro-GRP是一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，半衰期較長(19～28天)，pro-GRP與GRP具有共同的C端序列，可以代表GRP的水平以及基因表達(dá)情況[11]。除胎盤和胚胎組織外，pro-GRP在正常成人組織中很少表達(dá)，在外周血中表達(dá)較穩(wěn)定。多項研究[12-13]證實，pro-GRP診斷小細(xì)胞肺癌具有較高的敏感性和特異性，在肺癌腫瘤篩查中具有良好的應(yīng)用價值。Napsin A是一種功能性的天冬氨酸蛋白酶，能夠參與疏水性肺表面活性蛋白的水解，從而維持肺正常形態(tài)和功能[14]。在正常生理情況下，Napsin A于Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞以及肺泡巨噬細(xì)胞中表達(dá)，在肺腺癌組織中多呈陽性表達(dá)，但在鱗癌、小細(xì)胞癌中幾乎不表達(dá)[15]。本研究結(jié)果顯示，肺癌組pro-GRP陽性表達(dá)率顯著高于對照組，Napsin A陽性表達(dá)率顯著低于對照組，且肺癌患者中pro-GRP表達(dá)水平存在差異的患者其腫瘤大小、臨床分期、分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在顯著差異，而Napsin A表達(dá)水平存在差異的患者其病理類型、臨床分期、分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移亦存在顯著差異，表明pro-GRP和Napsin A表達(dá)水平可能與肺癌發(fā)生發(fā)展存在關(guān)聯(lián)。肺癌細(xì)胞可合成并釋放pro-GRP，且pro-GRP能夠經(jīng)過旁分泌作用促進(jìn)腫瘤生長，從而在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。Napsin A的減少、缺失能夠促進(jìn)肺癌進(jìn)展，該基因缺失表達(dá)可能使得細(xì)胞更加具有侵襲性。楊金華等[16]報道也表明，非小細(xì)胞肺癌組織中pro-GRP表達(dá)明顯升高，并可能參與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展。杜旭升等[17]研究同樣認(rèn)為，檢測Napsin A表達(dá)有助于判斷肺癌患者病情。本研究中，隨訪3年發(fā)現(xiàn)，死亡組pro-GRP陽性表達(dá)率顯著高于生存組，Napsin A陽性表達(dá)率顯著低于生存組，表明pro-GRP上調(diào)表達(dá)以及Napsin A下調(diào)表達(dá)能夠提示肺癌患者不良預(yù)后。馬永峰等[18]報道也發(fā)現(xiàn)，pro-GRP陽性表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者不良預(yù)后有關(guān)，死亡患者pro-GRP陽性表達(dá)率顯著高于生存患者，通過檢測pro-GRP表達(dá)水平并對患者及時給予干預(yù)，有可能減少患者術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。李燕舞等[19]研究顯示，血清pro-GRP高水平肺鱗癌患者總體生存率明顯低于低水平患者，分析pro-GRP表達(dá)水平能夠為患者預(yù)后評估提供重要指導(dǎo)。文獻(xiàn)報道[20]則指出，Napsin A在高分化腫瘤中過表達(dá)，且Napsin A表達(dá)缺失是肺癌患者生存期縮短的獨立因素。本研究多因素Cox風(fēng)險回歸分析顯示，分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pro-GRP和Napsin A表達(dá)水平是影響肺癌患者臨床預(yù)后的獨立因素。臨床上通過對低中分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pro-GRP陽性以及Napsin A陰性患者盡早進(jìn)行干預(yù)，有助于改善肺癌患者預(yù)后。此外，通過對肺癌組織中pro-GRP和Napsin A表達(dá)水平進(jìn)行分析研究，有助于深入闡明肺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，同時pro-GRP和Napsin A也有可能成為預(yù)測肺癌臨床預(yù)后的重要生物標(biāo)志物。但本研究僅分析了pro-GRP和Napsin A的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，二者在肺癌中上調(diào)表達(dá)和下調(diào)表達(dá)的具體機(jī)制有待明確，后續(xù)還需要開展更加深入的研究。

綜上所述，肺癌組織中pro-GRP表達(dá)水平上調(diào)，Napsin A表達(dá)水平下調(diào)，且二者表達(dá)水平與患者臨床預(yù)后存在密切關(guān)聯(lián)，有可能作為肺癌潛在的治療靶點以及臨床預(yù)后預(yù)測因子。