miR-95和miR-19b在骨肉瘤組織中的表達及與順鉑耐藥性的關系

雷小蕾 劉建峰 葉鐵良 張帥虎 袁國靜

骨肉瘤是兒童和青少年中最常見的原發性惡性骨腫瘤，約占所有兒科惡性腫瘤的2.4%[1]。骨肉瘤患者常用的化療藥物包括順鉑、阿霉素和甲氨蝶呤，但化療藥物耐藥情況也越發普遍[2]。化療藥物順鉑(cisplatin，CDDP)在臨床上主要用于實體瘤的治療，它抗癌譜廣，是目前已知的最有效的抗腫瘤藥物之一，也是骨肉瘤化療的一線用藥[3]。然而臨床上在使用順鉑化療的過程中，患者易產生耐藥，這可能與藥物的不規范使用、腫瘤細胞基因的不穩定性及高突變率等有關[4]。但是關于臨床治療中骨肉瘤化學耐藥性的分子機制尚不清楚。miRNA(microRNA)是一類由內源性基因編碼的非編碼單鏈 RNAs，長度約為 22 個核苷酸，主要在翻譯水平調控基因的表達[5]。miRNA 在腫瘤耐藥中發揮著重要作用，其在耐藥細胞和對藥物敏感的細胞中的表達量存在差異[6]。miR-95和 miR-19b 與多種類型腫瘤的發生高度相關[7]，但是與骨肉瘤以及順鉑耐藥性的關系尚不明確。因此本研究探討miR-95和 miR-19b 在骨肉瘤組織中的表達及與順鉑耐藥性的關系，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2016年2月至2020年2月本院收治的骨肉瘤患者100例，其中男性54名，女性46名，年齡6～69歲。納入標準：①符合《骨肉瘤臨床循證診療指南》[7]，經病理學確診骨肉瘤；②病歷、臨床資料完整；③患者簽署自愿受試同意書，患者及其家屬需簽署知情同意書。排除標準：①精神疾病患者；②合并其他惡性腫瘤患者；③合并其他器官嚴重性病變患者；④排除糖尿病、腎病等其他代謝性疾病的患者。

1.2 miR-95和 miR-19b 水平檢測

取骨肉瘤組織樣本，使用TRIzol RNA試劑盒(購自賽默飛世爾科技有限公司)提取總RNA，紫外分光光度計(上海美譜達公司)檢測總RNA 濃度及純度。取 2 μg 總 RNA 使用反轉錄試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司)進行反轉錄反應。取反轉錄產物進行PCR擴增，用2-ΔΔCt法計算各組基因的相對表達量。

1.3 化療耐藥分析

患者可根據鉑類耐藥評價標準[8]分為敏感組和耐藥組，敏感組為患者在化療完成后處于完全緩解狀態，后期復發間隔6個月以上；耐藥組為患者在化療完成后處于癥狀未緩解狀態或者處于完全緩解狀態但是后期復發間隔在6個月以內。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 miR-95和 miR-19b 表達與骨肉瘤患者的臨床病理參數關系分析

根據結果發現，miR-95和 miR-19b表達與性別無關(P均>0.05)，與臨床分期、腫瘤直徑以及遠處轉移有關(P均<0.05)，其中臨床分期Ⅲ期、腫瘤直徑≥5 cm、發生遠處轉移患者miR-95表達水平顯著低于其他患者(P<0.05)，臨床分期Ⅲ期、腫瘤直徑≥5 cm、發生遠處轉移患者miR-19b 表達水平顯著高于其他患者(P<0.05)，見表1。

表1 miR-95和 miR-19b表達與骨肉瘤的臨床病理資料關系

2.2 miR-95和 miR-19b表達與化療耐藥的關系

miR-95在耐藥組的表達水平明顯低于敏感組，差異有統計學意義(P<0.05)；miR-19b在耐藥組的表達水平明顯高于敏感組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 miR-95和 miR-19b在耐藥組與敏感組中的表達水平

2.3 miR-95和miR-19b對骨肉瘤患者化療耐藥的預測價值分析

根據ROC曲線分析可知，miR-95和miR-19b評估骨肉瘤患者化療耐藥的預測AUC分別為0.707、0.692，聯合檢測AUC為0.808，高于單獨檢測的AUC值。見表3，圖1。

表3 miR-95和 miR-19b聯合檢測骨肉瘤預測效能評價

圖1 miR-95和 miR-19b對骨肉瘤化療耐藥的預測價值ROC曲線分析

3 討論

骨肉瘤是高度惡性的間葉組織腫瘤，年發病率約為3/100萬，由于骨肉瘤局部侵襲性生長并易發生遠處轉移[9-10]。與其他癌癥類型相比，骨肉瘤的分子發病機制尚不清楚。骨肉瘤患者的5年總體和無病生存率為50%～60%，約40%的患者死于肺轉移[11]。近年來，順鉑的新輔助化療被廣泛用于降低骨肉瘤患者的復發率和提高生存率[12]。對化療藥物的耐藥性仍然是骨肉瘤和癌癥治療的主要問題。目前臨床上對化療耐藥的評價標準主要根據患者在化療結束后根據化療效果以及復發情況來判斷，不能及時根據耐藥情況調整治療藥物，影響患者的治療效果，因此尋找有效的針對子宮內膜癌化療耐藥情況的生物學指標對臨床研究具有重大意義。

miRNA 是一種高度保守的非編碼RNA分子，具有18～25個核苷酸，在轉錄后調節基因表達[13]。miRNA參與多種細胞過程，如分化、增殖和凋亡，這些過程在癌癥的發展中具有重要意義，越來越多的研究表明miRNA可能與癌癥的發生和發展密切相關[14-15]。miR-95過表達促進了腫瘤生長[16]。研究表明miR-19b可以促進乳腺癌細胞的腫瘤發生[17]。有研究稱與正常黑色素細胞相比，黑色素瘤細胞中miR-19b的表達顯著增加[18]。在骨肉瘤細胞中也發現了miR-19b的上調表達，并在這種惡性腫瘤中發揮了促癌作用[19]。但是miR-95和miR-19b在骨肉瘤的發病機制和化療耐藥中的潛在作用尚未闡明。本研究結果顯示：miR-95和miR-19b表達與臨床分期、腫瘤直徑以及遠處轉移有關，提示了miR-95和miR-19b可能參與了骨肉瘤的發生發展，但是具體發病機制亟待進一步研究。miR-95在耐藥組的表達水平明顯低于敏感組，miR-19b在耐藥組的表達水平明顯高于敏感組。miR-95和miR-19b評估骨肉瘤患者化療耐藥的預測AUC分別為0.707、0.692，聯合檢測AUC為0.808，高于單獨檢測的AUC值。說明miR-95和miR-19b水平與骨肉瘤對化療耐藥有關，與目前的研究所推測的一致，另外還發現其對骨肉瘤化療耐藥有一定的預測價值，可作為骨肉瘤化療耐藥相關生物標志物的潛力。

綜上所述，本研究證實了miR-95和miR-19b與骨肉瘤病理參數的關系以及對化療耐藥預測的價值，為未來尋求一種有效與骨肉瘤相關的生物標志物提供了數據基礎。然而本研究由于樣本量少以及中心單一等不足對研究結果可能產生一定的偏移，在未來的研究中需要更具前瞻性以及擴大樣本量來對結果進一步完善。